专访篇

CRISPR基因编辑技术到底是"魔剪"还是"乱箭"呢？为此，本期中国实验动物信息网特邀赛业生物科技集团技术副总裁、高级科学家欧阳应斌博士来说说CRISPR是"魔剪"还是"乱箭"这些事。

中国实验动物信息网：欧阳博士，5月30号Nature Methods上的一篇"Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo"掀起轩然大波，短短几天，科学界已经是山雨欲来，无人不在谈论这篇文章。CRISPR为什么有这么大威力？您能否先简短介绍一下这项技术的由来？

欧阳应斌：好的。30年前日本科学家石野良純在克隆一个古细菌的目的基因时偶然发现一种特别的重复序列，随后的10年研究人员一直在试图破解这种存在于很多细菌和古细菌的神秘序列，并冠以CRISPR这么个古怪的名称，直到10年前它的神秘面纱才开始被逐步揭开，原来它是一种以病毒DNA序列为精准打击对象的导弹防御系统。近几年以MIT张锋实验室为首的科学家把这种进化论产生的生物武器用在各个物种的基因改造上并把它发挥到了极致，从果蝇到斑马鱼到实验鼠到猴子，我们的工具箱里突然多了一种便捷高效的基因组编辑器，一种生命科学研究前所未有的利器，也让我们的科学家插上了想象的翅膀，我们甚至可以想象利用这把利器来纠正人类的基因缺陷。投资人闻讯赶到，把大笔的钱投给了科学家创办的公司，有的公司甚至成为公众公司，很快老百姓也知道了，把更多的钱投给了他们，幻想着在不远的将来收获巨大的利益。这大概就是为什么CRISPR如此威力巨大。

中国实验动物信息网：说起CRISPR的脱靶效应，这早已不是什么新闻了，一直以来脱靶似乎也没有那么可怕？

欧阳应斌：从CRISPR出道的第一天，关于它脱靶效应的正反文章就层出不穷，仿佛是一场攻防战，一方说有问题，另一方说问题不大、我有办法。最后的舆论导向仿佛是说CRISPR的脱靶效应在可控范围，而且张博士有预测脱靶效应的免费神器，只要大家遵照张博士的指引就无大碍，大家尽可放心使用。

中国实验动物信息网：与以前任何一次不同，这篇文章似乎造成了恐慌，喊了那么多次"狼"来了，为什么这次人们才意识到"狼"真的来了？

欧阳应斌：这篇文章一出，美国纳斯达克上市公司CRISPR Therapeutics的股价就应声下跌，我们公司一天之内收到N个客户电话询问我们对他们CRISPR项目的看法，并寻求预案。因为这次发现的问题彻底颠覆了之前大家对CRISPR脱靶效应的普遍看法。最突出的问题是，之前大家关注的脱靶主要是插入/缺失突变indel（insertion & deletion），而这次发现最多的脱靶却是点突变SNV（single-nucleotide variant），而且每只鼠有大约1700个点突变加上100多个indel。更匪夷所思的是，这些SNV和indel发生的位置都不在预测出来的脱靶位点上。

中国实验动物信息网：这次发现每只鼠达 1700个点突变，为什么到现在才被发现？

欧阳应斌：这个我也感到很不可思议。我的猜测是，大家一直没有往这个方向想，而且之前的测序深度不够，没有找到更可靠的技术发现点突变,并且研究者的关注点集中在预测出来的脱靶位点可能发生的indel。这次用的是50X的深度测序，而且关注点没有局限于脱靶位点和indel，而是拓展到全基因组的各种突变，问题就显现出来了。

中国实验动物信息网：据悉，脱靶现在可以用MIT张锋博士的公式和他们实验室的网站预测？另外很多人在质疑gRNA的设计问题，您怎么看？？

欧阳应斌：gRNA的设计确实直接影响脱靶，但不管这次的gRNA是如何设计的，我们的预测神器完全失灵了，预测出来的前50个脱靶位点没有一个发生脱靶。我们原来的认识是：脱靶风险是与gRNA和基因组相关位置之间的同源程度成正比的，这一次我们完全没有看到这种关系，这仿佛是要逼我们重新回到原点，重新审视脱靶的机理，原来的认识可能完全是错误的。

中国实验动物信息网：这篇文章是在小鼠上用CRISPR技术做基因突变，暴露了其严重的脱靶效应，但即使如此，我们是不是仍然可以通过一些办法来区分我们设计的基因突变与脱靶突变，继续用CRISPR在小鼠上做基因功能研究？

欧阳应斌：脱靶突变给小鼠模型带来的最大问题是我们不知道一个模型的表现型是我们设计的定点基因突变造成的还是我们不知道的某一个脱靶突变造成的。原则上来说，有两种传统办法可以帮助解决这个问题：一个是通过与野生鼠交配去除模型鼠中的脱靶突变，只剩下我们设计的基因突变；另一个是针对同一个模型多做几个line的鼠，看它们的表现型是不是一致的，如果一致，那这表现型就比较可能是我们设计的突变造成的。不幸的是，这篇文章的数据告诉我们这两种传统办法都无法解决CRISPR脱靶突变的问题。单说这1700个点突变和100多个indel，分布在每条染色体上平均有好几十个，通过与野生鼠交配去除这些突变是很困难的，因为每一代交配发生在每一条染色体上的同源重组平均也就不到一次，即使把这个突变数降低一个数量级，通过几代的交配来去除，仍然是非常困难的。更要命的是，这篇文章发现分别在两个line的鼠上的这大约1700个点突变和100多个indel大部分都是相同的，所以通过多拿到几个line的小鼠并得到相同的表现型来说明该表现型来自我们设计的基因突变而非脱靶突变是难以成立的，因为不同line的脱靶突变很可能也是一样的。当然深度的二代测序可以告诉我们脱靶的真相，但这太贵太耗时了，也不能去除脱靶突变。

中国实验动物信息网：您认为用CRISPR做小鼠的基因突变还可行吗？

欧阳应斌：与传统的ES细胞基因打靶技术制备基因工程小鼠相比，CRISPR技术的最大优点是快捷和低成本。但如果脱靶的问题不能解决的话，用该方法来制备基因工程小鼠显然远远没有ES基因打靶可靠，尤其是像条件性基因敲除（cKO）这样复杂昂贵的项目，实在不建议用CRISPR，因为不用花太多的代价和时间，完全可以用ES打靶这个久经考验的金标准。我们两年前推出的TurboKnockout技术平台，在传统ES基因打靶上引入了两项重大技术革新，进一步压缩了ES打靶的周期和成本，是加大了这个金标准的优势。我们的人工智能设计网站www.alphaknockout.com更是简化了方案的设计，我们的技术完全可以弥补CRISPR的不足。

中国实验动物信息网：非常感谢欧阳博士再次接受我们中国实验动物信息网的专访。