专访篇

本期中国实验动物信息网特邀华南理工大学医学院张文清教授为大家讲解斑马鱼的生物学特性、斑马鱼疾病动物模型制备及技术难点、斑马鱼疾病模型在药物筛选领域的应用等内容。

中国实验动物信息网：首先感谢张教授接受中国实验动物信息网的专访，据了解，自回国后您创建了国内医科大学领先的集酵母、果蝇、线虫、斑马鱼于一体的模式生物平台，特别是以斑马鱼模式生物开展相关研究获得多项重大成果、专利，请您谈谈最初是怎样与斑马鱼这种模式生物结缘的呢？ 

张教授：2004年我在英国从事血液病博士后研究时，适逢温子龙教授（2010年为香港科技大学终身教授）的介绍，当时他在新加坡建了独立实验室并进行造血发育研究。2005年我到他的实验室开始第二轮博士后训练，并在之后的工作中一直从事斑马鱼的造血发育、疾病模型与药物筛选工作。

通过双方10年的合作，我们利用斑马鱼发现了造血发育及白血病等血液病发生机制，建立了10余种血液病模型，针对5个模型开展了药物筛选工作【 Developmental Cell，2015；2016；2018；JEM，2017； eLife，2018； Development，2011；2012；2013；2018；Blood，2011；2012；2014；2015；2016；Leukemia，2013；2016；2017；JBC，2012等】。

中国实验动物信息网：请您介绍一下斑马鱼的生物学特性有哪些？它具有哪些独特的优势？

张教授：斑马鱼是近十几年内被广泛用于胚胎发育、疾病研究、药物筛选的脊椎动物模型。它在二十世纪三十年代开始被用于环境评价，1988年首次用于新药评估。在欧美，斑马鱼环境评估和药物研发已经得到了政府监管部门的GLP认证。

斑马鱼的生物特征:①它是脊椎动物，与人的组织机构和生理功能类似。与人基因同源性达到85%。②性成熟快，繁殖能力强。受精卵3-4个月性成熟，且每隔1-2周即可交配一次，使得试验周期大大宿短。③体积小，产卵量大。成鱼仅3cm左右，单次产卵量可达100-300个，适用于遗传学研究。④胚胎发育快。在标准饲养条件下，24h后大部分器官即形成。⑤体外受精，且早期胚胎透明。3天时全透明，3-7天时半透明，同时也有转基因的透明成鱼。可方便直接阅读多个器官的表型。⑥已完成全基因组的测序，生物信息易于获取。特别是近年来斑马鱼基因敲除技术（TALEN、 Cas9）的成熟，使得斑马鱼突变体容易获得，已有的突变体中部分与人类疾病表型类似。

斑马鱼在药物筛选中也展现出独特的优势。它不仅具有体外细胞实验的优点，同时也作为脊椎动物具有体内实验的优势。完美的结合了体内外实验的优势。

    ①与高通量的细胞模型相比有生物、靶点和一药多筛的优势。

    生物优势：斑马鱼是整体作为药物受试对象，可同时监测药效和毒性，这就可以在一开始排除掉毒性大的化合物，大大降低误筛率。并且斑马鱼胚胎透明，可镜下直视或通过免疫荧光（Immunofluorescence, IF）、整体原位杂交（whole mount in situ hybridization, WISH）或荧光蛋白转基因(Transgenic fluorescence, TF)等技术观察表型改变。降低药筛成本。

    靶点优势：斑马鱼与人类基因的同源性高，可以针对某个生物学表型而不是靶点进行药筛，可以寻找到未知的药物靶点。

    一药多筛：可同时观测分析多个器官系统的表型。

    ②与哺乳动物小鼠相比具有高通量、低费用、给药方便等优势。

    高通量：斑马鱼产卵数量多，且受精后的7天卵黄可提供胚胎营养而不用喂食，这就可以用96孔或384孔板进行药物筛选。

    低费用：斑马鱼饲养和消耗的费用远远低于实验鼠，平均每天每只消费约为实验鼠的1/100。

    给药方便：可直接将化合物溶于水中，扩散至胚胎中，所需化合物的量仅为实验鼠的1/100-1/1000。

中国实验动物信息网： 斑马鱼适用于开发哪些人类疾病模型？在技术上存在哪些难点？

张教授：斑马鱼适用于开发大部分遗传相关的人类疾病模型。斑马鱼正向或反向遗传学方法已成为发现候选药物的核心技术。正向遗传学是从表型变化研究基因变化，主要方法是化学突变（Chemical mutagenesis）和点突变（point mutagenesis）。反向遗传学则是从基因变化研究表型变化，主要方法是吗啉寡聚核苷酸（Morpholino oligonucleotides, MO）、锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)、定向诱导基因组局部突变（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes ，TILLING）、TAL效应蛋白靶向基因敲除技术（Transcription Activator-Like (TAL) Effector Nucleases，TALEN）、成簇调节回文重复序列/核酸内切酶Cas9技术（CRISPR/Cas9）(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 nucleases)等。

中国实验动物信息网：请张教授谈谈目前斑马鱼疾病模型在药物筛选领域的应用情况？在哪些领域已取得了突出的应用效果？

张教授：近年来，已经有一些研究团队使用斑马鱼在血液、心血管疾病、肥胖症、神经退行性疾病以及癌症等领域进行研究工作并取得一定的成果。

哈佛大学医学院zon课题组以runx1/scl标记造血干细胞，发现前列腺素E2（Prostaglandin E2， PCE2）能显著增加造血干细胞的数量，目前前列腺素修饰物dmPGE2（16,16-Dimethyl Prostaglandin E2）已经进入了临床研究。加州大学林硕课题组用kdrl标记血管内皮细胞，发现MPA化合物可以抑制血管新生。Jones等用斑马鱼Nille Red染料定量脂肪，检测了一些已知的促进脂肪代谢的药物，证明斑马鱼是很好的一种药物筛选模型。Cao等找到的去乙酰化酶抑制剂valproic acid可以缓解多囊肾的病情。在斑马鱼中用rag-2启动myc基因的过表达可以模拟人T淋巴细胞白血病。Patton等用黑色素细胞特异性的mitfa启动子启动BRAF（V600E）的表达，可以在斑马鱼中观察到大量黑色素斑块的形成。

斑马鱼作为人类疾病模型及药物筛选的平台已经在科研的舞台上崭露头角，但是斑马鱼进入药物筛选的时间还不够长，数据积累不够多，还缺乏很多与人类相对应的疾病模型。

中国实验动物信息网：可以介绍一下你们在“中国斑马鱼1号染色体全基因敲除”方面的工作吗？该项工作下一步有什么计划？

张教授：中国斑马鱼1号染色体全基因敲除联盟（Zebrafish All Genes KOConsortium for Chromosome 1，ZAKOC）”成立于2013年2月，在朱作言院士、孟安明院士倡导下，一群年轻的科学家们凭着对科学的不倦追求和对人类健康的使命感，在没有经费支持下自发开展了斑马鱼染色体全基因敲除研究。联盟包括30个实验室，平均每个实验室在15个月内完成约45个基因的敲除任务。目前统计，斑马鱼1号染色体上约1000个基因被成功敲除。后续工作一方面基于以上突变体破解这些基因的功能，建立疾病模型以及利用疾病模型进行机制研究以及药物筛选，另一方面斑马鱼联盟正在组织对血液、神经、消化、循环等系统发育相关的转录因子进行基因敲除、插入、转基因等工作。

中国实验动物信息网：国内有颁布相关的斑马鱼实验相关标准或者技术操作规程吗？在许可使用方面有没相关规定？

张教授：目前还没有，中国斑马鱼资源中心和中科院水生所正在整理。

中国实验动物信息网：感谢张教授接受中国实验动物信息网的特邀专访。