专访篇

目前小鼠模型有什么优势、面临的局限与挑战？免疫缺陷小鼠基础上建立的人源化移植小鼠模型有哪些优势与不足？人源化GEM模型研制的主要策略？人源化GEM模型应用中需要考虑与注意哪些因素？带着这些问题，本期中国实验动物信息网特邀赛业模式生物高级科学家俞晓峰博士为大家一一讲解。

中国实验动物信息网：请俞博士介绍一下小鼠模型的优势，其局限性与面临的挑战？ 

俞博士：目前，小鼠仍然是基础与药物研发的首选动物模型。特别是近交系小鼠的建立，使提供可重复的、且遗传性状一致的动物成为可能，也因此成为生物医药研究领域的重要工具。作为最早广泛应用的DBA/2近交小鼠构建于1929年，如今近交系小鼠已经有约450种，加上更多的近交系亚型，使不同小鼠品系包含了广泛的遗传多样性。应用这些不同近交系小鼠，有助于控制不同实验间与实验系统等相关因素，从而有利于鉴别与分析遗传影响和环境因素对实验结果的影响。而且，应用具有遗传背景一致性的同类小鼠，开展药物研发及毒性试验，也简化了分析解释研究结果的过程。因此，根据每个近交系小鼠所表现的独特表型与疾病倾向性等方面的优势，在过去的药物研发过程中，该类近交系小鼠发挥了极为重要的作用。

小鼠具有较短的生长期，繁殖维持相对容易，且与人有许多相似的生理学特征。而且，无论是自然引起的，或实验方式诱导的疾病模型，小鼠常常能产生与人相似的疾病。小鼠和人的基因组的序列信息都已经完全清楚，小鼠基因组与人基因组中相应基因中的对应率也在98%以上。

另外，早期针对小鼠的基因修饰技术的建立成功，也是广泛应用小鼠模型的重要原因之一。早在1970年代，由病毒转染成功获得了第一个转基因小鼠，但在实际应用中发现，由于该方法形成转基因随机插入后，常会导致DNA甲基化，从而沉默转基因表达。到1980年代早期，借助成功建立的DNA原核注射技术，制备了大量的能表达外源基因的转基因小鼠模型，其中包括许多表达人基因的小鼠。而小鼠胚胎干细胞（ES）系建立及基因打靶技术的发展，成为基因修饰小鼠（GEM）模型研制的又一个巨大突破。由于该方法的建立，研究者可构建研究所需的特定精确GEM模型。在组织特异性表达系统（如Cre/loxP）和可诱导系统（如Tet-system, Cre-ERT2) 领域的研究进展基础上，ES打靶技术可实现对特定基因进行组织特异性与可调控的修饰。

最近一系列的基因编辑新技术（比如ZFN，TALEN，以及CRISPR/Cas9）的建立，大大提高了受精卵注射方法精确遗传修饰的效率。由于该类基因编辑技术绕过ES细胞打靶过程，不仅缩短了研制周期，也使该类技术对哺乳类动物等其他生物体的基因修饰提供了可能。

虽然，小鼠等啮齿类动物与灵长类和人有许多地方很相似，但也存在明显不同，比如在肿瘤形成和免疫机制等方面，所以，小鼠模型本身不能准确反映人免疫系统和人癌发生发展过程。因此，在应用小鼠模型开展生物医药方面的研究时，需要了解并考虑如下因素：（1）小鼠与人之间基因及蛋白的同源性有多少；（2）不同种系间信号通路之间是否具有相似性；（3）如何解释小鼠和人之间相关疾病方面的生物学特征；（4）如何设计合理的实验策略。同时，研究者也必须清楚，动物模型就是模型，最好的动物模型也只是部分反映了人疾病的实际情况。因此，由小鼠模型研究获得的结果能否真实解释人相关疾病及药物作用效果等生物学现象，完全依赖于具体每个小鼠模型的正确有效性及个体特征。另外，由于小鼠与人的免疫系统存在的差异性，导致了某些致病微生物感染宿主的选择性，以及针对人靶向药物的特异性等影响因素，也使人们意识到传统常用的各种小鼠模型，在生物医药基础与应用研究中，表现出其存在的不足与局限性。

2001年有研究者的研究证实，小鼠和人的初生Fc受体（FcRn）存在明显差异，表现为人FcRn不结合小鼠IgG, 相反，虽然小鼠FcRn可结合人IgG，但其结合的亲和力却明显高于结合人FcRn。所以，作为分析人IgG血清半衰期或者作用效果时，野生小鼠不是一个好的药物动力学预测模型，即用传统小鼠模型研究人IgG半衰期具有明显的局限性。为了解决此问题，需要构建相应的人源化FcRn小鼠模型，使其更能模拟人状态的实际情况。

近年来，免疫检查点抑制剂的发现，促进了肿瘤免疫治疗新策略的建立与发展。2018年诺贝尔生理/医学奖获得者美国James Allison和日本Tasuku Honjo两位科学家也因首先提出肿瘤免疫疗法新理论，并成功开展针对CTLA-4和PD1两个分子作为肿瘤免疫治疗的基础研究，为最终临床上成功应用肿瘤免疫新疗法，发挥了巨大促进作用。然而，在实际临床治疗应用中发现，该类肿瘤免疫治疗仍有许多重要问题需要回答与解决，比如，为什么该疗法只对部分病人有效；哪些因素决定其反应性；宿主因素（如病人免疫状态，包括肿瘤微环境），和/或者肿瘤特殊因素的影响； 如何提高有效治疗范围（如有效联合疗法），使更多的病人能受益；如何发现和验证肿瘤免疫学的新靶点与分子，包括免疫检查点新靶点/抑制剂。但是，要想真正解答这些重要的生物医药问题，人们已经意识到，选择与建立恰当的临床前动物模型是非常关键的，即通过选用合适的人源化模型，在模拟人疾病状况条件下，提高评价和预测肿瘤免疫新疗法的准确性与可靠性。

过去常用的同源小鼠移植模型（syngeneic model)存在较多局限性： （1）多数小鼠肿瘤细胞系是来自致癌物诱导的小鼠模型，使其携带有复杂与不稳定遗传变异性，且难以真实反映人肿瘤细胞特性；（2）这类肿瘤细胞系多在体内生长迅速，使可供实验剂量的窗口期缩短，这些都不利于模拟肿瘤病人的真实状况；（3）只为针对小鼠靶点的肿瘤模型；（4）只有非常少的肿瘤类型和肿瘤细胞系适应测试肿瘤多样性，且这类模型在目前免疫治疗中，只有很少部分肿瘤细胞系（如MC38， CT26， H22和EMT-6）显示较好的效果。相比而言，已经上百个来自异种移植的人肿瘤细胞系，以及更多的肿瘤病人来源移植（PDX）小鼠模型应用于体内实验。

因此，在免疫缺陷小鼠体内，通过移植功能性人细胞/组织是重建人源化免疫系统，建立人肿瘤小鼠模型成为迫切需要。该类人源化移植小鼠模型的实际应用来自于30年前研究的启发，即由免疫缺陷SCID小鼠被人病毒 （如HIV， 人T细胞白血病病毒和EBV等）的成功感染。

新药研发的经验已经证明，开展新药物研发过程中的初步安全性、有效性与预测性、可重复性，以及临床上的适用性等相关研究，需要建立理想的临床前动物实验平台。而建立更加适合与满足生物医药研究应用的人源化小鼠模型，也是当前研究者所面临的巨大挑战，以及迫切需要解决的关键问题。

中国实验动物信息网：免疫缺陷小鼠基础上建立的人源化移植小鼠模型有哪些优势与不足？ 

俞博士：在上期关于“人源化小鼠模型在人类疾病研究中的应用”人物专访中，我就借助移植人细胞及组织至免疫缺陷（如NOG和NSG）小鼠体内构建人源化小鼠模型，进行了比较深入的介绍。在此只做简单的描述，该类人源化小鼠模型通常是通过三种基本的方式（人PMBC细胞、HSC细胞、或者BLT细胞）来构建人源化移植小鼠模型。主要可用于研究人特异性感染病原体, 如HIV、HCV、疟疾、I型糖尿病等感染性疾病，以及肿瘤免疫生物学及其免疫治疗等的临床前研究领域，如NOG/NSG人肿瘤细胞系（CDX）及组织移植等鼠人嵌合小鼠模型，以及PDX嵌合及人源化小鼠模型等，都已经发挥着越来越重要的作用。

这类人源化移植小鼠模型优势在于，可评价许多人特异性相关生物学疗法。在人肿瘤移植小鼠模型中，PDX作为肿瘤模型有较多的优势，比如检测病人疾病在分子和组织病理学特征方面，更具有临床试验结果的预测性。根据病人的病理诊断，基因组特征，治疗情况等相关信息，同时结合分析大量人白细胞抗原/HLA类型等的基础上，更能反应实际病人的多样性，为个性化精准治疗提供了参考依据。

人CD34细胞异种移植小鼠模型能使小鼠含人T细胞，B细胞，低水平低NK细胞和巨噬细胞，借助小鼠胸腺帮助，人CD4和CD8T细胞能继续分化与成熟，直到移植后32周。有假设认为，移植的人CD34细胞本身可形成人鼠嵌合胸腺微环境，使一些正常的人T细胞在人源化小鼠体内成熟。有报道证实，这些小鼠具有功能性免疫系统，包括T细胞反应，迟发超反应性（DTH）和B细胞反应（IgM)。这类人源化小鼠支持人肿瘤生长，比如PDX。在人肿瘤与人免疫系统情况下，有助于支持研究与评价免疫肿瘤机制和抗肿瘤治疗的可能性。目前，免疫检查点抑制物已经成为肿瘤治疗极具发展潜力的治疗策略，因此，建立能准确反映人肿瘤微环境复杂性及遗传特征，以及功能性人免疫系统的PDX人源化小鼠模型，无疑将有助于揭示肿瘤免疫新疗法的作用机制，评价治疗效果，评估其安全性，分析药物动力等方面的研究工作。

虽然，PDX人源化移植小鼠模型已经显示出非常的重要性与巨大潜力，但因受到科学理解及资源方面（比如经费和HSC来源）的限制，比如，在研发与建立此类模型过程中，如何提供可被肿瘤免疫学研究接受，且有应用价值的人源化小鼠模型，仍然面临着极大的挑战。胎肝是HSC的丰富来源，但因伦理及监管等方面的考虑，限制了其的广泛使用。脐带血是HSC另外一个常用来源，但HSC的含量却相对较低。可再生的HSC细胞资源，将是建立与应用PDX人源化移植小鼠模型的非常重要因素，然而，目前还没有如此的技术。而BLT移植方法的成本较高，且供体间有效成分的差异性等因素，间接影响了人细胞与组织的成功移植效率，也增加了该类人源化小鼠模型建立的不确定性。因此，尽管这几年在此研究领域的较大努力，但这方面的研究新报道却并不多。另外，对于应用这类人源化小鼠模型重建人免疫系统方面的研究也有限，且面临两个关键的挑战：1. 这类人源化移植小鼠中功能性人免疫系统仍不够全面，特别是获得性人体液免疫应答方面；2. 关于重建免疫系统与移植肿瘤的相互作用，能否代表特异性抗肿瘤免疫反应，异源反应，或两者结合的反应等问题。

中国实验动物信息网： 人源化GEM模型研制的主要策略？

俞博士：第一个人源化GEM模型是上世纪80年代，通过随机插入人cDNA至小鼠基因组中成功构建的。然而，随着基因修饰技术不断发展，对小鼠基因组进行人源化修饰的设计与策略也变得越来越多样与复杂了。对于采用何种基因修饰策略建立人源化GEM模型，首先需要考虑如下三个主要因素：1. 选择随机还是定点插入人基因；2. 选用什么样的调控系统来启动表达人基因；3. 选用什么类型DNA分子编码人蛋白。因此，在研制人源化GEM小模型之前，需要了解基因修饰技术策略本身的不同特点，并考虑其存在的可能不利因素和潜在风险，选择更适合自己研究及应用目的基因修饰策略，构建所需的人源化GEM模型。

一、选用何种方式插入人基因

将人基因插入小鼠基因组的人源化GEM模型的研制，通常有人基因随机插入和定点插入的两种方式。虽然，应用随机插入方式构建人转基因小鼠的策略，可通过选择最佳表达人转基因的首建鼠来获得，但由于随机插入策略存在破坏小鼠内源基因的可能风险，或者因人转基因插入小鼠基因组中非有利位点，引起所谓的位置效应（poition effects),  抑制插入基因的表达。而选用定点插入的打靶策略，则可以实现人基因单拷贝精确插入小鼠基因组中，避免了因多拷贝基因随机插入可能引起的潜在风险。定点插入的基因打靶策略，一般可采用如下几种方式来实现，1. 将人基因定点插入至小鼠基因组中易于接受外源基因转录表达的保险区域, 如Rosa26或胶原蛋白等基因位点;   2. 用人基因组部分（包括外显子与内含子）替换内源同源小鼠基因组相应部分；3. 将人基因部分外显子替换内源同源小鼠基因的相应部分外显子。虽然，无论是随机插入，还是定点插入人基因至小鼠无关基因组区域的策略，都能实现人蛋白在小鼠体内表达的目的。但是需要注意，只有当无小鼠同源修饰基因存在，或者同时表达小鼠蛋白不会干扰解释结果的情况下，应用该策略才有其实际意义。

通常情况下，不建议人源化GEM模型同时表达小鼠和人蛋白。因此，含有插入人转基因的小鼠可以通过与相应基因敲除小鼠的交配繁殖过程，以排除小鼠基因表达的影响。当然，也可通过定点替换的打靶策略，将人基因直接替换相应小鼠基因部分，达到避免了交配繁殖的耗时过程，实现一站式人源化GEM研制的目的。

二、选用何种启动子介导人基因的表达

选用何种启动子表达人基因与研究者的研究目是直接相关的。通常情况下，根据启动子来源不同，可分为三种不同类型的启动子：1. 异种启动子，即与所表达的人基因无关启动子。2. 与人基因相关的小鼠基因启动子；3. 同源人基因启动子。如果按照基因表达的部位与时间来区分，又可分为：全身表达启动子，组织特异性表达启动子，和可诱导表达的启动子。在研制人源化GEM模型的时候，选择何种启动子要根据人基因在小鼠体内表达的强度，区域范围及时间等方面因素的要求来决定。比如，人基因需要在小鼠体内全身表达，还是只是每个特定组织内表达，还是小鼠发育过程中的某个时期表达，还是只是在特定窗口期内表达，是需要长期表达，还是在诱导剂存在的条件下才表达等 。

一般来讲，如果希望人基因表达能反映正常生理学的自然条件下的情况，异种启动子是不适合选用的。因此，为了实现人基因能反应自然生理条件的表达情况，目前常用的策略是用同源人基因编码序列（如cDNA)替换相应小鼠的靶基因序列，使人基因的表达受小鼠同源基因启动子的调控。应用如此的人基因表达策略，有利于保留小鼠内源性增强子因素对基因表达的影响。然而，需要注意的是，小鼠内源启动子也不一定就能完全反映人基因表达的所有特征。而且，在有些情况下，与人基因同源的小鼠基因可能并不存在。因此，在这种情况下，建议考虑选用同源人基因启动子的策略。当然，使用该所谓的同源人基因启动子的策略也可能存在的风险，如载体中的人基因启动子所介导的人基因在小鼠体内的表达方式，未必就能直接反映其在人体内的实际情况，这可能与小鼠体内缺乏相关的增强子因素，以及小鼠的有关转录因子与人基因启动子结合位点相互作用不够充分等因素有关。

三、选用什么类型DNA分子编码人蛋白

在前面描述的人基因插入策略中，强调了人源化GEM模型研制中，人基因插入方式（如随机和定点等）的选用。如果将编码人蛋白的人基因插入替换方式，按DNA分子类型来划分，又可分为如下类型：1.人cDNA；2. 人基因组；3. 人cDNA与基因组的混合。在某些情况下，也可应用人部分cDNA分子替换相应小鼠部分序列（如编码蛋白相应特殊功能区域）， 达到实现人源化基因修饰的目的。

一般而言，用人基因cDNAs策略的替换方式，构建人转基因载体较为直接简便。而选用人基因组载体的方式，因该类载体包含了正常基因内含子和外显子结构区域，载体通常都比较大，增加了制备过程的难度。但该策略的优势是，由于保留了基因组内含子中可能存在的关键增强子因素，从而降低了影响基因表达相关因素的潜在风险，使研制的人源化GEM模型倾向有较好表达效果。而且，人基因组载体也使得表达人不同剪接变异体成为可能，这对某些能形成不同生理学特征的基因独特亚型转录体，以及某些重要序列作为人基因调控表达的关键部分的时候，选用此策略就显得有特别的实际意义。更为重要的是，在人源化GEM模型中，人基因组载体的正确外显子拼接效果，也更易受到细胞拼接机制的保护。从目前发展的趋势来看，选用基因组策略构建人源化GEM模型已明显增加。当然，由于大范围基因组替换工作具有一定挑战性，间接影响了此类人源化GEM模型在实际研制中的广泛应用。

应用细菌人造染色体（BAC）或酵母人造染色体（YAC) 构建人基因组序列是研制人源化GEM模型的经典策略。应用重组工程（recombineering)技术方法，构建巨大人基因组载体，通过同源重组或定点特异性重组的方式，达到实现用人基因组片段替代相应小鼠基因组片段的目的。

选用什么的策略与技术方法构建人源化GEM模型，还是要根据这些方法自身的特殊优势与不足，结合实际研究中需要回答的特殊问题进行考虑。同时，在计划开始构建新的人源化GEM模型时，需要清楚的明白，目前还没有一种方法技术是能满足所有不同目的的实际应用。所以，选用何种研制策略，需要根据实验研究的目的，现有的资源，以及未来该模型的应用等方面因素权衡考虑，选择最适合实际具体情况的研究目的。

中国实验动物信息网：人源化GEM模型有哪些构建方法及其特点？

俞博士：人源化GEM模型构建方法按技术方法发展过程及其特征，通常可将其分为如下三种主要技术方法：1.  原核注射的转基因技术；2. 基于ES细胞基因打靶为基础的同源重组技术；3. 核酸酶介导的基因编辑技术（目前以CRISPR-Cas9为主）。如果按人基因导入小鼠基因组方式进行分类，又可以简单分为原核注射技术方法和ES细胞基因打靶两种主要方法。

最早通过原核注射技术研制转基因小鼠成功于1982年。应用显微注射方式将DNA导入小鼠受精卵的原核或细胞浆，然后筛选阳性后代基因型，获得能表达注射DNA基因的首建鼠，从而实现建立杂合子或纯合子表达插入基因小鼠系的目的。

转基因方法的主要优势在于直接简单，且快速。导入的DNA分子可覆盖不同范围大小，比如从单核苷酸到大片段基因组载体（如BAC或YAC)，并能对来自不同品系小鼠的受精卵进行操作。另外，应用组织特异性性与可诱导启动子，可分别实现广泛表达，组织特异性，以及可诱导表达的人转基因GEM模型研制的目的。通常情况下，应用此技术研制的人转基因小鼠，多是通过人cDNA与全身表达或组织特异性表达启动子结合实现的。但如果想要表达的基因更接近正常生理状态情况，建议选用较大片段的人基因组片段（如BAC），因为大片段基因组DNA包括了某些原本不太清楚，却有可能发挥实际功能的调控序列。而从另一方面讲，由于大片段DNA载体的同源重组或定点特异整合效率低，且缺乏有效筛选DNA大片段插入发生，也有可能含有其他基因等因素，限制了人基因定点插入小鼠受精卵方法的应用。

然而，以DNA随机插入的基因导入方式，也成为该转基因技术的明显不足。由于基因插入位置效应（position effect) 的影响，导致插入基因表达水平难以预测。而且，该转基因技术也无法控制基因插入的拷贝数量。另外，基因的随机插入也有存在破坏小鼠内源性基因的风险，导致不依赖于转基因表达的可能表型现象，从而影响了实验结果的准确性与可靠性。当然，该转基因技术因其简单快速，成本低，又无物种限制等特点，仍被认为是一种较为常用的建立人源化GEM模型的方法之一，但研究者在选择该技术之前，建议首先需要较全面地了解该技术的优缺点。

核酸酶介导的基因编辑技术（ZFNs，TALENs和CRISPR/Cas9）也是通过原核或胞浆注射的方式，制备人源化GEM模型。近年来，已有大量应用TALEN和CRISPR/Cas9方法，成功研制基因修饰小鼠的报道。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术是借助靶向gRNA-Cas9核酸酶复合物，引起特定双链DNA断裂，然后通过非同源性末端链接（NHEJ）的错误修复，达到破坏靶基因的目的。如果需要应用CRISPR/Cas9技术实现人相关基因的插入或替换，则只需要在靶向gRNA-Cas9核酸酶的基础上，加上含相应同源序列的人基因载体，并通过显微注射的方法，将gRNA-Cas9-人基因DNA载体导入小鼠受精卵，引起人基因定点插入小鼠基因组中，实现研制人源化GEM模型的目的。

如同上面介绍的转基因技术，CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术也是通过受精卵注射方法，实施对基因进行修饰编辑的，因此，该技术不仅具有了转基因的快速，成本低，无物种限制等优势，而且，也具有对基因进行定点修饰的功能，使其成为一种更快，相对简单的人源化GEM模型研制方法。当然，研究者也需要知道，该技术方法本身存在的某些有待解决的技术问题，比如，脱靶效应，大片段DNA定点插入效率等，也在一定程度上限制了其实际应用。

小鼠ES细胞的体外培养系统于1980年早期的成功建立，为开展小鼠基因精确修饰操作打下了基础。而1987年基因同源重组技术在ES细胞中成功更是一重大突破，使精确敲除特定DNA序列，构建基因敲除小鼠成为可能。ES基因打靶技术的成功建立，为研制各种人源化GEM模型创造了条件。

经过30多年的发展，ES打靶技术已经成为非常成熟，且稳定可靠的基因修饰方法。该技术的核心过程包括；构建包含需要修饰的基因片段，筛选/抗性标记物等部分的DNA打靶载体；打靶载体由电转方式导入ES细胞，利用载体中的抗性筛选基因（如Neomycin) ，筛选经药物G418（Geneticin)作用后能存活的ES细胞克隆，通过PCR/Southern blot鉴定发生同源重组的阳性ES克隆。再将阳性打靶ES细胞克隆注射入小鼠宿主囊胚中，并移植至假孕母体小鼠体内，产生嵌合体小鼠。该嵌合小鼠与野生小鼠交配后，获得具有生殖传递ES 细胞性状的基因修饰小鼠，然后通过基因型鉴定，决定基因特定修饰的阳性杂合子小鼠，以供纯合子小鼠制备。一般而言，ES细胞的生殖传递活性可通过小鼠毛发颜色来观察判断，因此，借助ES细胞与宿主胚胎产生不同的毛发颜色的特点，可以比较容易推测ES细胞在嵌合小鼠中的比例及其可能的传递效率。

通过同源重组原理建立的ES打靶技术，成功实现了对相应基因进行特定替换修饰。但该技术在实际操作中，也存在某些不足之处，例如，有时候打靶效率低，则需要筛选较多的ES细胞克隆。有些阳性ES细胞克隆的生殖系传递过程，不仅比较消耗时间，且难以保证成功。另外， ES细胞经体外培养多代后，也有可能损失其生殖系传递能力。虽然，此种情况可以通过筛选多个打靶ES细胞克隆，或使用不同的ES细胞系来克服，但这些努力都会消耗资源和时间。与DNA显微注射制备转基因和CRISPR/Cas9方法比较，ES细胞囊胚注射制备的杂合子小鼠，需要通过先获得的嵌合体小鼠过程，不仅增加了研制周期，也增加了可能无法获得生殖系传递小鼠的机会。从而增加了研制过程的不确定性，有时候以至于最终无法成功。而且，更加关键的是，关于ES细胞系的背景与种属问题（虽然有所改善），仍然是该方法一个限制因素，因为通过回交方式达到所需小鼠背景操作过程，也是非常消耗时间的。

赛业生物在传统ES细胞打靶基础上，通过建立高效生殖遗传能力的TetraOne ES细胞系，以及Neo筛选基因的自删除系统等技术创新，创立新型ES细胞打靶的TurboKnockout技术, 实现较传统ES细胞打靶研制基因修饰小鼠模型的周期，缩短至少3-4月以上，从而使该技术仍然保持了其在基因修饰模式动物构建中所具有的特殊优势。

当然，在未来到底哪种技术方法更会被人们广泛接受与认可，这取决于多方面的因素，包括这些技术方法的相对有效性，是否易于操作使用，以及被学术界团体易于理解程度等因素。虽然，近来新出现的以CRISPR/Cas9技术为代表的核酸酶介导基因编辑技术，使得通过直接在小鼠受精卵细胞内，进行基因定点修饰成为可能，从而实现绕过ES打靶方式，研制更加复杂的基因修饰小鼠模型。但尽管如此，可以预见，未来对于相对复杂，或者大片段基因组等修饰人源化GEM模型研制，ES细胞打靶技术方法仍然会是值得推荐的选择。 

中国实验动物信息网：人源化GEM模型在生物医药研究领域中有哪些应用？

俞博士：1、人源化GEM模型在人源化抗体及其相关受体研制中的应用

应用人源化GEM模型，实现在小鼠体内制备人源化抗体，达到生产治疗性抗体，或者体内抗体药效及毒性评价等，已成为当前应用人源化GEM模型的一个非常活跃的应用研究领域。

不同与以前体外生产人源化抗体的技术方法，通过小鼠体内直接生产人源化抗体，由于经过体内自然筛选过程，因而其获得的人源化抗体，无论在亲和力与抗体形成的后加工修饰等方面，都显示其巨大实际应用优势。因此，目前许多生物制药公司都在探索与尝试应用人源化GEM模型研制人抗体方面的技术方法，也成功研制一些能表达人抗体的人源化GEM模型，并成功研发出可应用临床的人源化抗体药物。当前，具有代表性的人源化GEM模型的研制主要有三种修饰策略，第一种被称之为“ 敲除加转基因策略” ； 该基因修饰的原则是分别构建小鼠抗体基因敲除的小鼠与人抗体YAC转基因小鼠，然后通过两种小鼠模型互交方式，获得能表达人抗体的人源化GEM模型。第二种是“ 交换嵌合策略” 。该策略是由美国Regeneron药业集团研发的VelocImmun小鼠，也被认为是人源化GEM模型认为最为成功的例子之一，该策略的原则是将含人抗体基因重链和轻链可变区大片段基因组（～1 Mb）替换小鼠抗体相应基因组区域（～2.5 Mb),  经过至少八轮以上的ES打靶过程来实现的，实现生产人源化抗体可变区与小鼠抗体恒定区的人鼠嵌合抗体。因此，此类人鼠嵌合抗体具有参与抗原识别功能的人抗体可变区作用，而鼠抗体恒定区则有利于其在体内介导效应功能，达到更佳适合在小鼠体内制备人鼠嵌合抗体的目的。然而，考虑到小鼠抗体可变区域还存在其他潜在功能基因，直接用人抗体可变区基因组替换小鼠相应区域，可能引起的潜在风险，第三种人源化抗体小鼠模型采用“插入与反转策略”，即将人抗体可变区基因组片段插入至小鼠抗体可变区与恒定区之间，然后再将两loxP序列反向插入小鼠抗体可变区基因组两端，在Cre重组酶的作用下，引起小鼠抗体可变区基因组的反转，达到“敲除” 其活性的作用，但却实现保留该区域内相应小鼠基因功能的目的。

2001年研究者发现，作为体内参与抗体回收利用的新生Fc受体 （FcRn），在不同种属之间（如人和小鼠）存在明显差异，提出应用小鼠模型研究人IgG的半衰期的局限性。为了解决此问题，应用基因修饰技术研制人源化GEM模型，达到更模拟人状态情况。因此，建立FcRn人源化GEM模型，已经成为目前可预测Fc为基础复合物的药代动力学的常用模型，特别是对人源化单克隆抗体验证。通过筛选Fc基因修饰蛋白的理想半衰期，预测治疗性抗体的药代动力学，指导抗体人临床研究。

人源化FcRn小鼠模型的建立是按传统的敲除加转基因的策略实现的，即首先应用ES打靶技术敲除小鼠的FcRn基因，再应用转基因技术构建表达人FcRn基因的首建鼠，然后两种GEM模型互交获得人源化FcRn小鼠模型。这类人源化FcRn小鼠模型可应用于药物动力学研究，特别是针对Fc基因修饰抗体，其半衰期长短则是该类单克隆抗体重要特征之一。比如，有研究在不同小鼠（如B6， FcRn敲除，人源化FcRn）模型中，比较了野生抗体trastuzumab和三种Fc基因修饰的变异体抗体的半衰期，发现对于Fc基因修饰的变异体抗体而言，人源化FcRn小鼠模型的识别性最佳，而野生B6小鼠无法区别经过修饰的这三种变异体抗体。应用人源化GEM模型可以很好的区分这两种变异体抗体，从而有助于根据抗体在体内血清中的半衰期，对其进行排列，达到进一步显示抗体与非人灵长类研究结果的相关性。这些研究结果表明，这类人源化GEM模型在药物动力学分析方面提供了更加可信的工具，为抗体应用于非人灵长类动物和人类具有实际指导意义。

在深入了解FcRn回收利用机制的基础上，通过利用融合短寿命蛋白或小分子至抗体Fc结合域，以达到延长其半衰期的目的，则是一个很自然的设想。为了考核这些可能潜在Fc融合分子的药代动力学及效果，应用人源化FcRn小鼠，为开展新且具有治疗性潜力的研究提供了基础。例如，应用该小鼠模型研究重组因子VIII和Fc的融合蛋白，结果表明，与因子VIII蛋白本身比较，因子VIII与Fc融合后，其在血清中的半衰期增加了两倍。所以，为进一步开发Fc携带复合物，人源化FcRn小鼠模型应用于人血清药代动力学方面的研究，以及作为强有力的预测指标将会不断增加。

虽然人源化FcRn小鼠目前主要应用于药物动力学研究，该模型也很容易被应用于药物功效试验。比如对单抗药物效果的验证，相对于抗体在小鼠FcRn的人为半衰期，人源化FcRn小鼠更能反映抗体的真实生理学半衰期。

应用细胞系或原代肿瘤组织移植免疫缺陷小鼠的肿瘤异种移植研究，已经成为常规抗肿瘤药物疗效试验的小鼠模型。如果实现对以Fc基础/或白蛋白基础的复合物效果测试，则需要正确的FcRn组成，因此，可通过将人源化FcRn小鼠与免疫缺陷SCID背景小鼠（Prkdc/SzJ）回交来实现。应用人源化FcRn小鼠/Rag1敲除小鼠的异种移植方法，对抗血管内皮生长因子（VEGF）单抗和抗表皮生长因子受体（EGFR）单抗药效进行验证，通过对两种常用抗体（如bevacizumab and cetuximab) 与由新Xtend技术研制的Fc基因修饰的抗体进行比较研究，分析不同抗体对FcR的亲和力增加效果。首先用人卵巢癌细胞系SKOV-3/人表皮癌细胞系A431建立异种移植肿瘤模型，然后用以上未经修饰的野生抗体和经Xtend修饰的抗体变异体干预治疗，结果表明，经Xtend技术修饰过单抗不仅可以明显延长抗体半衰期5倍以上，且也表现有更好的抗肿瘤效果。此研究充分显示了人源化FcRn小鼠模型的实际应用价值。

2、人源化GEM模型在人感染性疾病模型建立中的应用

许多感染的人病原体对小鼠等啮齿类动物不敏感，这可能与小鼠等动物缺乏感染所需的特殊宿主因子有关。比如，人乙型/丙型肝炎病毒（HBV/HCV），中东呼吸综合症冠状病毒（MERS），麻疹病毒，链球菌，脑膜炎球菌等，野生小鼠等啮齿类动物的这种天然抵抗力，可能与该类动物缺乏感染所需的特殊宿主因子（病原体无结合小鼠细胞表面相关分子而无法有效复制）有关。有研究发现，人蛋白CD81和封闭蛋白（occludin) 是HCV感染人细胞的两个关键因子，构建表达此两个人蛋白的人源化GEM模型，均能使HCV颗粒感染此类小鼠成功，这为建立小鼠模型研究HCV感染与免疫提供了可能。

通过对人中东呼吸综合症发病机理的研究，研究者揭示了MERS感染人细胞是通过结合细胞表面的DPP4 （CD26）分子实现的。 因此，应用替换敲入的基因修饰策略，将人DPP4 （约82kb) 基因组序列替换小鼠相应区域的基因组序列，构建人源化DPP4敲入模型，结果表明，该人源化GEM模型不仅可成功建立MERS感染疾病小鼠模型，且能作为抗MERS人抗体治疗效果的临床前应用的评估动物模型。国内研究者最近也成功通过转基因表达人DD4基因的策略，成功建立了MERS感染的小鼠，并成功应用该人源化GEM模型，对一种新型的纳米抗体的抗MERS中和保护作用效果进行评估。

最近，有报道通过在小鼠体内表达HBV/HDV功能性受体NTCP, 成功构建了可被HDV病毒感染的人源化GEM模型，虽然HDV病毒的急性感染还不足以引起非常严重肝损伤，但却引发明显的相关细胞的先天免疫应答。应用相应的抗病毒药物（如myrcludex B and lonafarnib ）能有效抑制病毒血症，虽然在实验剂量范围内还不能达到完全治愈的效果。该HDV-hNTCP人源化GEM模型的建立，为以后HDV病毒感染的病理机制，细胞免疫应答反应，研究抗HDV新疗法效果的评估提供了可能。

另外，通过构建人源化CD46转基因GEM模型，可实现多种病原微生物（如麻疹病毒，疱疹病毒，腺病毒，脑膜双炎球菌，淋球菌，化脓性链球菌等）直接感染小鼠成功的报道。

3、人源化GEM模型在改善型免疫缺陷小鼠研制中的应用

为了改善免疫缺陷小鼠模型移植人细胞/组织的有效性，发挥相应人免疫系统在小鼠体内的活性与功能，在原来NOG/NSG等免疫缺陷小鼠基础上，借助基因修饰技术导入人相关细胞因子，成功构建了多种 “改善型” 的免疫缺陷小鼠模型。通常导入与髓系类细胞发育成熟相关的人细胞因子，如IL-3，GM-CSF，具有明显增加移植人造型干细胞在小鼠体内的成熟，重建人免疫系统，以及人肿瘤组织移植的效率。耶鲁大学Flavell课题组通过基因打靶技术，将多种人细胞因子（如IL-3，GM-CSF/M-CSF，TPO，SIRPa) 导入BRG小鼠的ES细胞，成功构建了MISTRG小鼠模型。虽然此改善型小鼠有助于改善人髓系细胞在小鼠体内活性，以及肿瘤组织移植效率，但移植后小鼠却表现有较为明显的贫血症状等副作用，造成小鼠移植后存活时间缩短。分析认为，造成的原因可能与成熟的人巨噬细胞对小鼠红细胞造成吞噬作用，以及人造血干细胞对小鼠相应细胞的破坏作用有关。因此，平衡导入恰当数量人相关细胞因子也是此类人源化GEM模型构建需要考虑的因素。

根据研究目的的不同，可选择导入不同的人细胞因子。通常通过移植成熟人PBMC至NOG/NSG小鼠的方法，可开展人源化小鼠模型评估疫苗效果研究。然后，由于人PBMC移植后容易引起异种移植物宿主疾病（GvHD), 从而限制了其实际应用。有研究表明，通过将人IL-4细胞因子导入NOG小鼠，构建NOG-hIL-4人源化GEM模型，大大降低了人PBMC移植NOG-hIL-4人源化小鼠模型发生GvHD风险，并成功应用于针对肿瘤疫苗（抗-HER2肽）IgG抗体反应的验证研究，为今后相应疫苗效果验证提供了有效工具。

最近，耶鲁大学医学院的Flavell课题组，在免疫缺陷BRG小鼠基础上，分别导入人SIRPa和IL-15基因，成功构建了SRG-15人源化GEM模型。结果表明，该人源化SRG-15小鼠明显有助于人NK和CD8-T细胞发育与功能成熟，促进先天性淋巴细胞的发育。在比较抗肿瘤治疗抗体（rituximab）抗肿瘤效果的评价实验中证实， 与常用的免疫缺陷NSG小鼠相比，SRG-15人源化小鼠表现为更为有效的抑制肿瘤生长的作用。因此，该人源化SRG-15模型的建立，也为临床前评价人NK细胞新靶向治疗效果，探索抗肿瘤治疗联合疗法的协同作用，以及体内研究人抗肿瘤免疫反应机制等提供了工具。另外，在NSG基础上敲入三个人基因（如IL-3, hGM-CSF和hSCR-KTL) 的SMG3小鼠，或在NOG基础上敲入两个人基因（如IL-3，hGM-CSF)的小鼠被认为是第二代免疫缺陷小鼠，具有更佳的人造血干细胞重建的效果，特别是对人骨髓细胞系。

4、人源化GEM模型的其他方面的常见应用

不同的物种在药物代谢与处置，以及其相关调节网络方面存在不同。这也就造成了药物毒性，药物之间相互作用特征，或药物的效果等方面在小鼠和人之间都会表现明显的差异。因此，应用人源化GEM模型研究药物代谢和处置特征是非常必要的。在该类人源化GEM模型的研制领域中，已经成功建立了包括针对外源生物质受体如芳香烃受体（AHR）, 组成雄烷受体（CAR），过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARa） 和孕烷X受体（PXR）等， 以及针对细胞色素P450 (CYP) 家族成员的，如CYP2A6, CYP2C9, CYP2C18/2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A7； 以及针对UDP 葡糖醛酸基转运酶 （UGT）和2B7和NAT转运酶2等。

虽然，由于小鼠和人之间存在普遍生理学方面的差异，或者人源化基因选择性等方面因素，使这类人源化GEM模型仍存在一定的局限。然而，相对于目前的体外技术，这些人源化GEM模型，作为评估药物体内代谢与处置反应系统，如在人药物体内相互作用，毒性，致癌性，和药效等方面研究，已经显示出其显著的实际价值。另外，与野生小鼠相比，细胞色素P450人源化GEM模型在体内鉴定与安全评价方面，也更能准确反映人代谢产物的实际状况。

目前，构建MHC类I和II的人源化GEM模型，也是研究者非常关注的研究领域。现在已经成功构建了不同的HLA-I （A1， A3，A11，A24，B7，B27等）和II （DR1， DR2， DR3， DR4， DP4，DQ2, DQ3, DQ6等）的人源化GEM模型，并已经应用于基础免疫学，疫苗研发，自身免疫性疾病，以及感染性疾病等研究。

除了MHC人源化GEM模型外，研究者也构建了T细胞受体（TCR）转基因的人源化GEM模型。比如，将鼠TCR基因a和b部分敲除小鼠与人完整TCRa和b转基因小鼠交配后，获得能补偿小鼠TCR功能的完全人TCR小鼠模型。将该小鼠再与HLA-A*0201人源化转基因小鼠交配，可得到较小鼠TCR产生更多CD8阳性T细胞的效果。此模型有可能作为研究TCR参与人健康与疾病的有用工具。

中国实验动物信息网：人源化GEM模型应用中需要考虑与注意哪些因素？

俞博士：随着基因修饰技术的不断进步与发展，构建复杂精确人源化GEM模型的能力也随之增加。目前已经成功研制了有大量有应用价值的这类模型，并广泛应用基础研究，药物研发，以及临床前药物毒性评价等多个领域。比如，将人PD-1和CTLA-4基因定点敲入至小鼠的相应基因位点，使人源化抗人PD-1和CTLA-4抗体能识别小鼠体内相应靶点，从而达到在小鼠体内验证人源化抗体免疫治疗效果的目的；还有将人Fc gamma受体基因插入获得的人源化GEM模型，可用于针对肿瘤抗原抗体获得性免疫疗法的效果验证。

虽然人源化GEM模型应用已经显示其巨大的潜力，然而，在研制此类模型过程中，由于存在许多不同构建方法技术与策略可供参考，因此，需要在做出最终选择决定之前，有必要对各种技术方法特点，制备周期，研发资源和研究目的等进行谨慎考虑与比较，做出适合研究者研究目的的选择。研究者需要了解人源化GEM模型可能存在的如下的局限与潜在难题，第一，无论选择那种技术方法研制此类模型，从技术上和生物学上方面考虑都依然存在风险。特别是对于大片段基因组人源化GEM模型的构建，在考虑技术能力方面的同时，还需要考虑与之相关的制备周期，成本等因素。对于没有经验的研究者，在开始尝试此类模型研制的项目计划前，建议寻求相关专家的建议与帮助。而且，研究者也需要了解，即使事先对研制设计策略考虑周到，并能实现人转基因正确表达特征，但人转基因在小鼠体内的功能表现却是难以保证的。第二，对于新研制的人源化GEM模型，如果缺乏该相关基因的相应历史背景资料，也会不利于该类人源化小鼠在一定领域的直接应用。第三，一般情况下，人源化GEM模型的建立是针对某一个基因，或在最佳情况下，可以选择几个基因，实现人源化的基因修饰。因此，需要记住的是，该类所谓的人源化GEM模型的本质仍然是小鼠，而非人。虽然，小鼠与人通常在生理学或病理学方面有相似性，但两者不是完全相同的。所以，在开展实验前，需要非常清楚研究的目的，谨慎制定设计策略与选择恰当模型构建方式。通常情况下，如果没有获得满意的预期实验结果，可能与研究计划与设计，不清晰，或者选择了不恰当的模型有关，而非模型本身缺陷的原因。

尽管人缘化GEM模型存在一定的局限与制约，但该类小鼠模型在深入了解人疾病和研发新药等研究领域的应用，仍具有巨大发展潜力与未来。而且，借助基因编辑新技术的不断出现与发展，也必将有助于促进与扩大研制更加精致和预测性强的人源化GEM模型 。

中国实验动物信息网：非常感谢俞博士接受中国实验动物信息网的特邀专访。