专访篇

为什么称人羊膜干细胞是神奇的“万能细胞”？它有哪些特征和优势？其在糖尿病、纤维化疾病（肝、肺）等的临床研究上有怎样的显著效果？为此，本期中国实验动物信息网特邀教育部长江特聘教授、南昌大学转化医学研究院辛洪波院长为大家详细讲解。

中国实验动物信息网：2018年9月19日，您受邀在“华东地区第十五届实验动物科学学术交流会”上做了关于“人羊膜干细胞”的专家报告，引起了现场专家学者和广大科技工作者的广泛关注。请辛教授您介绍一下人羊膜干细胞的特征？为什么称它是神奇的“万能细胞”？ 

辛洪波教授：顾名思义，人羊膜干细胞是从新生胎儿羊膜上分离得到的干细胞，它包括羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞。另外，从羊水中也可以分离到大量的干细胞，由于羊水不好收集，且容易污染，因此，羊水来源干细胞的应用也受到限制。羊膜干细胞（包括羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞）来源丰富、分离过程简单，且具有很强的多分化潜能、无伦理障碍、增殖能力强、体内体外无致瘤作用、低免疫原性及可透过血脑屏障等特征。前人的研究结果及本实验室的前期数据表明，人羊膜干细胞在体外可分化为心肌细胞、胰岛β细胞、肝脏细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经元等来自三个不同胚层的细胞，而这些细胞免疫原性极低，表明进行组织细胞移植时不容易发生排斥反应。同时，羊膜干细胞可分泌大量的细胞因子，通过旁分泌作用达到抑制炎症、参与免疫调节的功效。此外，羊膜干细胞的分化潜能基本上可以与胚胎干细胞相媲美，但其无伦理障碍，无致瘤作用及低免疫原性是其优点，而与iPS相比，虽能后者有低免疫原性的优点，但其致瘤作用又是一很难逾越的鸿沟。因此，鉴于羊膜干细胞及其干细胞因子在治疗诸多临床疾病如糖尿病、急性肝损伤、肺损伤、脑中风、阿尔茨海默症、纤维化类疾病、视网膜黄斑病变、卵巢早衰症及肿瘤等疾病方面具有显著的疗效，因此它被誉为“万能细胞”。

中国实验动物信息网：目前，国内外人羊膜干细胞的研究现状如何？ 

辛洪波教授：实际上，早在100多年前，美国FDA就批准人羊膜可用于皮肤损伤如烧伤等的修复，提示人羊膜具有再生的能力。而真正开始对羊膜及羊水干细胞进行较为系统的研究则以Atala及其同事于2007年发表在Nature Biotechnology的工作为标志。他们利用中期孕妇的羊水或分娩后的羊膜中分离得到的干细胞对其基本特征及分化潜能进行了较为系统的研究。遗憾的是，羊膜干细胞作为一种成体间充质干细胞，其受关注程度显著低于脐血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞及脐带间充质干细胞等。近年来，越来越多的国内外研究者意识到了羊膜干细胞的优越性及重要性，并开展了相关研究。

目前，国内外研究者主要聚焦于羊膜上皮干细胞的多分化潜能及羊膜间充质干细胞的免疫调节、炎症抑制及旁分泌作用。目前已经证明羊膜上皮干细胞体外可分化为具有功能的胰岛β细胞、肝脏细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经元等，并在整体动物水平上证明了羊膜间充质干细胞具有治疗中风、肺损伤、肝纤维化、肝硬化、大脑损伤、皮肤损伤及肿瘤等的潜能。我国科学家近年来也在羊膜干细胞研究方面取得了可喜的成绩，实验研究发现羊膜上皮干细胞可应用于桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮、脊髓损伤、卵巢早衰、葡萄膜炎、视网膜黄斑病变等的治疗。

国内外科学家在进行基础研究的同时，也在探索羊膜干细胞临床应用的安全性及有效性。2018年2月，澳大利亚乐卓博大学和莫纳什大学等机构的研究人员证实给中风患者注射人羊膜干细胞可有效减少脑部疾病，同时有助于患者的恢复。同年8月，莫纳什大学的研究者又将羊膜上皮干细胞移植进入支气管肺发育不良的早产儿体内，初步证明了羊膜干细胞治疗支气管发育不良的作用及其安全性。我们有理由相信人羊膜干细胞在临床中的广泛应用指日可待。

中国实验动物信息网： 请您为大家分享一下人羊膜来源的干细胞分离、培养及鉴定的方法？您研究团队在人羊膜干细胞检测方面已经开展了哪些工作？取得了哪些成效？

辛洪波教授：从医院取回新生胎儿的胎盘之后，首先将羊膜分离并进行清洗。清洗后的羊膜经胰蛋白酶消化1小时，之后将消化下来的细胞过200目细胞筛，得到的单细胞再通过Pecroll梯度离心分选SSEA-4阳性的羊膜上皮干细胞。剩余的羊膜经胶原酶4继续消化，并经磁珠分选得到CD117阳性的羊膜间充质干细胞。羊膜上皮干细胞体外培养呈卵圆形，羊膜间充质干细胞呈长梭形。我们通过RT-PCR、流式及免疫荧光检测羊膜上皮干细胞及羊膜间充质干细胞是否表达胚胎干细胞表面标志蛋白SSEA-4、Nanog、OCT-4，胚胎干细胞表面标志蛋白CD73、CD105、CD29、CD90，造血干细胞标志蛋白CD34和CD133，主要组织相容性Ⅰ类抗原（HLA-ABC），及Ⅱ类抗原（HLA-DR）。

此外，我们还检测了羊膜上皮干细胞体内及体外的致瘤性。同时，为区分羊膜上皮干细胞及羊膜间充质干细胞，我们还检测了上皮干细胞标志蛋白E-cadherin。通过检测我们发现，羊膜上皮干细胞加羊膜间充质干细胞都表达胚胎干细胞标志蛋白SSEA-4、Nanog、OCT-4，表达间充质干细胞标志蛋白CD73、CD105、CD29，不表达造血干细胞标志蛋白CD34和CD133，低表达HLA-ABC，不表达HLA-DR，体内外均安全不致瘤。我们还发现羊膜上皮干细胞不表达间充质干细胞标志蛋白CD90，间充质干细胞在体内及体外具有成骨及成脂分化潜能。

中国实验动物信息网：您在报告会上介绍到人羊膜干细胞在人类疾病方面已突显了其重要的价值，特别在糖尿病、纤维化疾病（肝、肺）等的治疗作用，请辛教授您谈谈它具体的临床应用情况？

辛洪波教授：我们实验室在前期的研究过程中发现，羊膜上皮干细胞体外可以分化具有功能的胰岛β细胞。这种胰岛β细胞可响应葡萄糖刺激继而分泌胰岛素。更为重要的是我们将该类细胞通过肾包膜移植入I型糖尿病模型小鼠（非免疫缺陷）体内，小鼠在移植后第6天血糖就开始下降，到12天基本恢复正常。目前，已经在超过半年的时间内维持I型糖尿病小鼠血糖在正常水平。我们是将人的细胞移植进入非免疫缺陷小鼠体内，取得如此理想的治疗效果，提示着通过移植羊膜上皮干细胞诱导产生的β细胞不仅在治疗I型糖尿病切实可行，而且在我们进行的治疗期内没有观察到排斥反应。

此外，我们也设计了体外将羊膜上皮干细胞诱导分化为功能性肝脏细胞的诱导体系，并观察到羊膜上皮干细胞诱导产生的肝脏细胞可显著提高急性肝损伤小鼠的存活率。同样，我们将羊膜上皮干细胞或羊膜间充质干细胞移植进入动物体内，发现其可抑制肝脏纤维化及肺纤维化。目前我们也在积极的推进这几个项目的临床应用，正在制定相应的SOP和招募志愿者。

中国实验动物信息网：您认为羊膜干细胞在治疗方面还急需攻克哪些难关？后续还需要开展哪些研究工作？

辛洪波教授：我们通过实验发现，羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞都具有较低的免疫排斥反应，在小鼠体内可以长时间存活。但是在其他方面，确实有一些需要攻克的难关。首先，临床治疗对干细胞的数量和质量均具有较高要求，这就要求我们尽量进行悬浮培养和无血清培养。如何使得在悬浮培养条件及无血清条件下保持羊膜干细胞的活性、多能性、干性及增殖能力是我们急需解决的问题。

在具体的实验上，比如说羊膜干细胞治疗I型糖尿病。目前，我们羊膜上皮干细胞分化为胰岛β细胞比例大概在30%左右，β细胞体内移植存在供氧问题，这些因素都制约了它的临床应用。如何提高羊膜上皮干细胞体外分化为胰岛β细胞的比例，如何提高β细胞的体内移植的存活率也是我们急需解决的问题。

在后续工作中，我们首先要尽快制定羊膜干细胞体外分离、培养及鉴定的行业标准及标准化SOP。其次，在具体疾病上，我们要探索羊膜干细胞及其衍生细胞的给药途径、给药方式及给药剂量。

最后，很多疾病在动物模型上具有明显的治疗效果不代表其在人体上也具有效果，我们应尽快明确羊膜干细胞临床上治疗I型糖尿病、II型糖尿病、肝纤维化、肝损伤、肺损伤及肿瘤等疾病的有效性。

中国实验动物信息网：您预期羊膜干细胞未来的应用前景如何？

辛洪波教授：我们注意到，广州日报在2018年10月30日发表了一篇题为《干细胞将像智能手机般改变生活，未来5-10年“慢病”或能根治》的文章。的确，鉴于羊膜干细胞具有来源丰富、增殖能力及潜能分化强、无伦理障碍，无致瘤作用及低免疫原性等特点，它势必将成为一类最具临床应用前景的干细胞。尤其值得指出的是，羊膜干细胞在多潜能分化上，基本上可以与胚胎干细胞相媲美，但其无伦理障碍，无致瘤作用及低免疫原性是其优点，而与iPS相比，虽能后者有低免疫原性的优点，但其致瘤作用又是一很难逾越的鸿沟。因此，我们有理由预期，羊膜干细胞将是干细胞领域中最具发展潜力的神奇细胞。我们期待在不久的将来，应用干细胞药品将使我们人类诸多的慢性疾病如II型糖尿病、阿尔茨海默症、肝及肺纤维化等得到有效的治疗，而像I型糖尿病、肝损伤等需要进行细胞移植治疗的疾病，也可通过羊膜干细胞诱导分化成对应的终末细胞而进行有效的移植治疗。

中国实验动物信息网：感谢辛教授接受中国实验动物信息网的特邀专访。