专访篇

赵教授团队在利用斑马鱼模型评价人突变基因在疾病发生中作用与机制取得重要研究进展，本期中国实验动物信息网特邀南京大学模式动物研究所赵庆顺教授为您讲解以模式动物斑马鱼如何有效评价人突变基因的功能等精彩内容。

中国实验动物信息网：感谢赵教授接受中国实验动物信息网的专访。近年来，斑马鱼在生物医药、生命科学的应用研究越来越广泛。赵教授团队在利用斑马鱼模型评价人突变基因在疾病发生中作用与机制取得重要研究进展，请您为大家介绍下这项研究的策略？

赵庆顺教授：利用斑马鱼模型评价人基因功能的研究策略可简述为：1、详细了解与病人临床特征（包括生化指标等具体临床诊断指标）共分离的突变等位基因遗传特征：是杂合突变、复合杂合突变还是纯合突变；2、借助生物信息学手段分析基因突变性质以建立利用斑马鱼模型评价人突变基因功能的方法。“杂合突变”通常是功能获得或显性负效（部分剂量激活或剂量不足）突变，功能获得或显性负效突变（或剂量激活）可采用在胚胎中暂时性过表达或建稳定转基因鱼系的方法来进行突变基因功能评价，而“纯合突变”或“复合杂合突变（以及剂量不足的杂合突变）”通常是功能缺失突变，可通过基因敲降（暂时性）或基因敲除（永久性）的方法建立斑马鱼模型来进行突变基因功能评价；进一步地，可开展拯救实验在基因敲降或敲除斑马鱼模型中过表达人野生型等位基因或突变等位基因以进一步确认突变基因功能（野生型可拯救表型而突变型不能）；3、利用斑马鱼模型在显微形态学或转录组学水平上寻找与病人临床特征共分离的突变等位基因是否为疾病致病基因的实验证据；4、针对建立的人类疾病斑马鱼模型，运用遗传学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学以及生物化学等多种技术手段解析致病机制。

中国实验动物信息网：您刚刚在谈到研究策略中，提到了关于分离现象，请您谈谈人基因突变与疾病共分离现象？

赵庆顺教授：病人基因组始终携带突变的等位基因，而健康者基因组中对应的位置则始终是野生型等位基因，这在遗传学上被称为突变（基因）与疾病（临床特征）共分离现象，即基因型与表型共分离。在很多情况下，与疾病共分离的突变基因可能并不是致病基因本身，而只是一个遗传学标识。真正的致病基因可能恰恰是位于这个遗传学标识的附近，与遗传学标识呈紧密连锁，但还没有被辨识出来。这就意味着“共分离的突变基因并不必然是致病基因”。因而，对于共分离基因，首先需要"利用斑马鱼模型从显微形态学或转录组学水平上寻找与病人临床特征共分离的突变基因是否为疾病致病基因的实验证据"。现在，经由全基因组或全外显子组测序较容易发现病人携带很多“与疾病共分离的基因”，但这些与疾病共分离的基因是否为致病的突变基因，则需要利用斑马鱼等动物模型来加以检验或评价。

中国实验动物信息网：斑马鱼模型与细胞、小鼠模型等相比较，斑马鱼模型在评价基因功能方面有什么优势？

赵庆顺教授：由于缺乏疾病发生时的体内时空特异环境特征，细胞模型很显然无法模拟人类疾病。因而，利用整体动物模拟人类疾病建立动物的疾病模型是必须的。不同动物中存在着同源基因乃至同源器官，这种进化上的保守性为建立人类疾病的动物模型提供了从分子生物学到形态学水平的理论依据。虽然许多疾病表型可以同时在小鼠和斑马鱼上模拟出来，但由于动物本身的特点，有些疾病只能在斑马鱼上才能模拟出来（当然，也有些疾病只能在小鼠上模拟出来）。譬如，在与多指相关的Bardet-Biedl综合征研究中，反常的模式可在斑马鱼的鳍芽基上重现，但小鼠模型却没有表型。事实上，由于斑马鱼与人一样都是昼行动物，在某些遗传基础方面，斑马鱼比小鼠更接近于人。例如：已知低水平的褪黑激素与精神分裂症密切相关，但近交纯系小鼠不再能够合成褪黑激素，而斑马鱼松果腺却能够合成。再者，在人和斑马鱼中，主要的压力性激素是肾上腺皮质醇可的松，而小鼠的是肾上腺酮。因此，斑马鱼的这些特征可能会为那些长期以来无法获得有效小鼠模型的人类疾病（譬如精神分裂症）建立替代的斑马鱼模型提供了可能。

此外，以斑马鱼模型评价人突变基因功能的优势在于可通过对过表达或基因敲降的斑马鱼胚胎的显微形态学变化或转录组水平改变等的观测，明确这些变化是否表型模拟了病人的临床特征（或病理学指标），从而可快速判断病人携带的基因突变是否为有害突变。这种快速及操作简便的优势，极大地有利于对大量候选的与疾病共分离的突变基因进行快速地筛选，从而为进一步确认突变基因是否为致病基因并进行机制解析奠定基础。

中国实验动物信息网：请赵教授介绍一下目前斑马鱼模型在评价人基因功能方面的研究成效，给大家分享一些成功的应用案例？

赵庆顺教授：

家系病人突变基因功能验证案例：某家系是一个心率异常遗传家系，通过对整个家系包括先证者在内的相关成员进行全外显子测序，发现某个基因以杂合突变形式与心率异常临床特征共分离。为确定与疾病共分离的该突变基因是否为致病基因，我们在斑马鱼胚胎中过表达该突变基因与野生型等位基因，经过对实验结果进行分析，发现突变基因与心率异常密切相关。结合临床特征，我们推测该基因可能以一种显性负效（dominant negative）形式发挥致病作用。以此建立的该疾病的斑马鱼模型，为进一步解析该基因在疾病中的分子病理作用机制奠定了基础。在实际工作者，我们的实验结果是在病人具体临床症状被告知前获得，双盲的测试增强了结果的可信度。该评判策略可使研究者能够在多个与疾病共分离的基因中快速确定候选致病基因。

中国实验动物信息网：用斑马鱼建立人类疾病模型由来已久，而通过基因编辑技术建立人类疾病的斑马鱼模型是一项重要突破，请您介绍下这项研究的创新性和先进性？

赵庆顺教授：基因组编辑技术发明之前，基因组靶向修饰只能通过传统的基因打靶技术在小鼠身上得以实现。基因组编辑技术的发明，使得在任何物种上的基因组靶向修饰成为可能。作为一种脊椎动物，斑马鱼基因组与人类基因组高度保守，大约82%的人类疾病基因在斑马鱼上有同源基因，其中69%为直系同源基因。在人与模式动物的基因功能的保守互换上，斑马鱼和小鼠基因在不少情况下有相同的功效。研究表明，将斑马鱼基因替换为人基因，可以用来说明这些突变的基因是否可以支持鱼的发育和功能。有意思的是，虽然很多人类的疾病可以同时用小鼠和斑马鱼进行模拟，但是也有相当多的情况下，有些疾病只能用斑马鱼或者只能用小鼠来进行模拟。

中国实验动物信息网：您认为该项研究还需攻克哪些技术难点？您预期斑马鱼模型未来在人基因功能研究方面的应用前景？

赵庆顺教授：在斑马鱼模型建立中，基因敲入技术是目前急需攻克的技术难点。尽管在进化上高度保守，斑马鱼与人享有很多共同的发育生物学与分子生物学过程，但是具体到很多突变本身特别是在氨基酸水平上的点突变并不像啮齿动物那样具有很好的保守性，因此通过基因敲入构建人源基因的转基因斑马鱼模型实现斑马鱼模型的人源化成为优选。