专访篇：本期中国实验动物信息网特邀赛业生物副总裁、高级科学家俞晓峰博士就小鼠疾病模型特征及其在药物研发的临床前评价研究内容作详细的讲解。

中国实验动物信息网：为什么要构建小鼠疾病模型及其在药物临床前评价研究中的应用？

俞晓峰：小鼠模型在模式生物中所具有的独特综合优势，不仅表现在遗传学与生理学上与人具有相似性，也有其成本低、繁殖饲养快速方便、遗传背景明确、以及相应基因编辑技术成熟等有利因素，使其成为生物医药领域研究，包括基因功能及致病过程、建立人相关疾病模型和药物临床前评价研究等最为重要的模式动物。通过小鼠疾病模型的构建，有助于我们深入揭示潜在致病基因作用机制，为药物临床前评价研究提供工具，成为由药物研发基础研究向临床疾病治疗应用有效转化的重要桥梁。

在此，借用周斌教授2020年发表的成功研究案例，简要说明小鼠疾病模型应用于转化医学研究中的思路与策略。作者首先从家族性高胆固醇血糖临床患者人群中，筛查到低密度脂蛋白受体（LDLR）未知新突变E207X，且体外细胞实验证实，表达突变LDLR基因与其功能改变具有相关性。为了进一步在体内证实该LDLR基因突变与高胆固醇血症/动物粥样硬化的因果关系，我们应用CRISPR/Cas9基本编辑技术，为作者专门定制了Ldlr-E208X(对应人LDLR-E207X）点突变小鼠模型。研究结果表明，该Ldlr-E208X点突变小鼠模型在高脂饮食诱导下，表现与临床患者相似的高胆固醇血症及动脉粥样硬化表型，从而建立了模拟家族性人胆固醇血症及动脉粥样硬化患者的小鼠疾病模型，为进一步探索该疾病基因疗法的临床前评价研究提供了可能。

作者在Ldlr-E208X点突变小鼠疾病模型基础上，验证基因编辑修正疗法治疗该疾病的可能性与效果。通过将构建的AAV8载体介导CRISPR/Cas9编辑基因治疗技术注射到突变小鼠肝脏，观察小鼠体内正常Ldlr蛋白表达水平及其相关表型变化，结果表明，Ldlr蛋白表达不仅获得一定程度恢复，且其原有的高胆固醇血症及动脉粥样硬化表型，也都获得一定程度的改善。该研究结果证明，通过对人疾病相关致病基因的筛选，建立能正确模拟人相关疾病表型特征的小鼠疾病模型，为药物研发的临床前有效性评价研究奠定了基础。

中国实验动物信息网：小鼠疾病模型在遗传性疾病基因治疗研究中发挥了什么作用？

俞晓峰：许多人疾病发生与基因突变直接相关，研究表明，有超过15000基因突变与包括肿瘤、代谢、神经和心血管等疾病发生有关。另外，目前已报道的罕见病（也称孤儿病）超过 ～7,000多种 ，且有超过80%与基因突变密切相关。遗传性罕见病已经影响到超过3.5亿人群，且多为儿童(～50%)。 这类疾病通常严重、临床诊断与治疗多复杂、且多呈慢性发展。目前绝大多数遗传罕见病（～95%）仍无有效治疗方法。另外，与传统药物研发投入比较，遗传性罕见疾病药物研发投入相对较少。因此，针对遗传性疾病治疗方法及药物研发已成为当前科学家们与生物制药行业积极关注的研究领域。然而，由于这类遗传性罕见病的患者人数少，不利于药物（孤儿药）研发的临床试验研究开展，也成为此类药物研发面临的特殊挑战。

小鼠与人遗传基因组的相似性高达约98%，小鼠疾病模型构建应用于药物临床前评价研究，又具有其特殊的诸多优势。因此，小鼠疾病模型在孤儿药临床前研发过程中，从致病基因的发现与验证，到药物的有效性与安全性评价研究，更显示出其重要的特殊应用价值。

小鼠疾病模型有助于遗传性疾病致病基因的发现与验证。如同周斌教授的成功研究案例，就是将临床患者中筛选到潜在致病基因，通过相应基因编辑技术，构建能与人相关疾病病理表型关联的小鼠疾病模型，并将其与人疾病病理症状特征与相关基因联系起来，达到验证与揭示潜在致病基因在诱发疾病表型过程的作用机制。

小鼠疾病模型研究也是人相关疾病药物研发的起点。早期阶段科学假说与潜在疾病药物治疗效果评价，始于小鼠疾病模型构建及其实验室研究。伴随着CRISPR编辑技术的诞生与发展，使得构建基因编辑小鼠疾病模型模拟人相关疾病更加简便有效。 通过构建转基因、基因敲除或特定突变小鼠疾病模型等，已广泛应用于遗传性罕见病、肿瘤、代谢和心血管等疾病等人相关疾病的研究。应用小鼠疾病模型研究遗传性相关疾病，比如，脊髓性肌萎缩症（SMA）、遗传性视网膜疾病（IRD）、阿尓滋海默症（AD）等疾病致病机制与潜在药物的临床前研发，发挥了积极的促进作用。2019年，由诺华研发的治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)婴儿患者的基因疗法（Zolgensma），获美国FDA批准上市。该药成为首款获批上市的一次性基因治疗方案（定价212.5万美元），也是目前最贵的一个基因替代治疗的突破性疗法，因而具有里程碑意义。应用SMN基因敲除小鼠，研究SMA早期基因治疗效果表明，对SMN敲除小鼠出生后一天，进行scAAV9-SMN基因治疗，可明显改善SMA小鼠神经肌肉生理学、运动功能障碍及存活时间。而对出生后5天和10天后小鼠进行相同注射治疗，效果则随之明显下降。提示基因治疗时间的早晚与其治疗效果密切相关。

眼睛被公认为是基因治疗的理想靶器官。因为第一眼睛有紧密血视网膜屏障(BRB)，使视网膜成为相对免疫特权组织。对于外来抗原(比如病毒载体)具有耐受性，不会引起严重免疫炎症反应；第二眼睛局部注射病毒载体，引起病毒广泛扩散风险也很低，降低了可能出现的全身副反应发生；第三眼睛器官组织小，需要病毒载体量也相对少，也降低了潜在毒副作用；第四眼睛部位手术也相对容易操作，便于实施玻璃体内和视网膜下注射病毒载体，达到治疗靶区域；第五视网膜细胞为分化和非分裂细胞，即使用非整合载体（比如AAV），也不用担心转基因的丢失；第六用非侵入方法，可较易检测基因治疗后，视力功能及视网膜结构等变化；第七典型遗传性视网膜疾病为双侧对称性变性，易于设置治疗对照。

先天性黑矇(LCA)是基因治疗眼科疾病的理想选择，相对与光感（PR）细胞而言，RPE65基因表达位于视网膜色素上皮细胞(RPE)层，因而更加便于AAV载体发挥其有效作用。另外，RPE65基因缺失导致的严重视力减退过程，发生于20～30年间，并维持相对保守的视网膜结构变化。这也为基因治疗发挥其恢复视力功能提供了较好机会。2017年，美国FDA批准了Spark公司AAV-RPE65基因疗法(Luxturna)，达到恢复与改善先天性黑矇(LCA)患者视力作用。该疗法售价高达75万美元/一只眼(150万/患者)。

通过构建Rpe65基因敲除小鼠模型，建立先天性黑矇(LCA)小鼠疾病模型的研究发现，小鼠视锥光传导特异性相关基因表达显著降低，引起小鼠早期视锥细胞损失，使光感细胞平衡状态破坏，导致视网膜细胞死亡。 注射9-或11-顺式视黄醛至2周龄Rpe65敲除小鼠，可增加该小鼠注射区域视锥细胞数密度2倍。 提示缺乏顺式视黄醛可能参与早期视锥细胞衰退变性过程。

目前针对遗传性疾病常用基因治疗主要策略如下：1、DNA基因替代/增加疗法：导入新基因取代突变基因。但对于显性突变情况，抑制突变基因活性，则是需要首先考虑的治疗策略。2、CRISPR/Cas9基因编辑疗法：两种治疗策略，包括直接在体内修改突变基因，或者通过体外修改患者来源的相关细胞，再回输编辑后细胞至治疗部位保护。主要的挑战：如何增加非分裂细胞基因组重组修复效率，因为此类细胞多缺乏HDR机制。3、RNA基因治疗方法：不需要将基因传送至细胞核，大大降低基因整合至宿主基因组风险的优势。治疗策略包括RNA剪切修饰、转录后基因剪切和RNA编辑等。主要挑战：降低mRNA传送过程可能引起的免疫原性，以及提高其稳定性。

重组AAV病毒载体则是目前基因治疗最为常用的病毒载体。优点：通常不会引起明显的免疫反应，也不会融入到宿主基因组，能够在启动子的控制下表达。缺点：因为不整合到细胞DNA中，当细胞分裂时，就会丢失。AAV载体包括两种类型：单链AAV (ssAAV)和自我互补AAV (scAAV)载体。 当细胞被ssAAV传导后，单链病毒DNA需要先转化为双链形式，这是限速步骤，成为不利因素。scAAV载体病毒感染细胞后，立即以自我互补方式，形成双链DNA，加速病毒复制及基因表达过程，提升了效率。但scAAV载体包装容量只是ssAAV载体的一半(～2.4kb) 。到目前为止，已经在人和灵长类动物中发现与鉴定有超过12个（约100个变异体）AAV载体。其中血清型2、5、7、8和9为目前较为常用的AAV病毒载体。

中国实验动物信息网：小鼠疾病模型在药物临床前评价研究中面临的挑战？

俞晓峰：小鼠疾病模型在转化医学研究中已发挥了极其重要的作用，无论是从致病基因功能到新药研发的临床前评价研究等方面。然而，关于小鼠疾病模型应用于药物临床前评价研究预测有效性的问题，也一直也都是科学家们及生物医药企业十分关注与思考的问题。已有的经验教训表明，如何构建小鼠疾病模型，以及如何从已有的模型中选择合理的小鼠疾病模型等，都会直接影响到药物临床前评价研究结果的转化效率。比如，由于肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠疾病模型的错误选择，导致大多数临床前验证实验通过的药物，到了临床试验阶段，却以失败告终。

ALS也叫运动神经元病(MND), 影响中枢神经系统上下运动神经。ALS患者出现扩张性肌肉消耗和萎缩，导致瘫痪，疾病出现后3-5年死亡。ALS分为家族性(fALS,10%) 和散发性(sALS, 90%)。 目前已经报道约50多个基因突变与ALS发生相关，但病理性突变相关致病基因多集中在SOD1, C9ORF72, FUS和TDP-43。

ALS小鼠疾病模型的构建为深入探索与揭示ALS病理学机制，以及开展药物临床前评价研究等，发挥了重要作用。比如，最早的SOD1基因突变转基因小鼠疾病模型构建，为ALS的早期研究铺平了道路。1993年，SOD1作为第一个ALS致病相关基因首先发现，该基因突变占家族性ALS∼20% 和 散发性ALS∼2%,  且该基因编码区域突变超过150，可以引起显性毒性作用。 目前已成功构建了超过20多种啮齿类动物模型，多为人SOD1基因突变体的随机过表达小鼠模型，而SOD1基因敲除小鼠模型却未见任何表型。

人SOD1G93A点突变转基因小鼠，是最早、且应用最多的ALS小鼠疾病模型，用于约97%的ALS药物临床前评价实验研究。其次为SOD1G37R突变小鼠。应用人SOD1基因启动子及调控序列，表达人SOD1基因G93A突变体，构建不同人源化SOD1突变体转基因小鼠模型。研究表明，有SOD1G93A突变小鼠含有25个拷贝的人SOD1G93A突变体，比内源性小鼠SOD1基因的表达量高约13倍。初步的研究发现，不同的人SOD1基因突变转基因小鼠，虽然在疾病症状出现时间与严重程度等方面表现不同，但都会出现不同程度与人ALS疾病相似的进行性运动神经元疾病表型。

然而，以后的进一步深入研究这些所谓小鼠ALS疾病模型发现，大多数人SOD1G93A突变转基因小鼠，并未出现出现人ALS疾病患者中非常重要的病理特征，即出现大量脑皮层运动神经元退行性变化。因此，有人认为，作为人运动神经元疾病特征的研究工具，SOD1G93A突变小鼠疾病模型本有其先天不足。

另外，更为有趣的发现是，如果在小鼠体内过表达人野生型SOD1基因，也能诱发小鼠一定程度的神经元损伤表型，说明SOD1蛋白过度表达聚集，具有毒性作用。有人提出，与过度蛋白聚集的毒性假设一致，疾病发生严重程度与外源基因拷贝数增加（不管是突变体还是野生体）密切相关关系。因此，有理由怀疑，应用SOD1突变小鼠疾病模型，虽然可能对ALS致病机制研究有所帮助，但如果开展药物临床前评价研究，可能难以发挥其临床有效转化的作用。过去在针对ALS疾病的药物临床试验中，除了一个药物（riluzole）表现有中等程度延缓疾病发生作用外，其他潜在药物均在临床试验中遭遇失败，也许就是个很好的证明。

关于家族型与散发型ALS表型及病理机制的问题。SOD1突变较少存在于散发型ALS患者中，但散发型ALS表型与家族型ALS相似，有研究者认为，这两种类型ALS可能具有共同的神经退行性通路。所以，研究家族型ALS有助于深入了解散发型ALS病理机制。但也研究者有不同观点，认为SOD1突变小鼠模型可能只反映家族型ALS患者表型，而不是哪些散发型ALS患者，或者98%的非家族型ALS患者基因突变现象。

ALS研究的新发现，即突变TDP-43蛋白引起异常RNA加工过程。TDP-43蛋白为TARDBP基因编码，是DNA/RNA结合蛋白。已发现超过48个TARBDP基因变异体与ALS疾病相关。 研究表明，虽然TDP-43突变只占家族性ALS患者3%，但运动神经元内的高磷酸化突变截短蛋白聚集和/或泛素化TDP-43存在现象，却参与了超过95%ALS患者脑部与脊髓神经衰退性变化。由于TDP-43蛋白具有RNA加工、传递和剪切等功能，目前认为，TDP-43突变与大多数ALS疾病的发生相关。关于TDP-43致病理论依据是，该突变蛋白与一些相关RNA结合后，通过蛋白增加毒性功能机制，改变这些RNA在细胞质内的代谢过程。该基因如果在细胞核内被去除，则是通过蛋白缺失功能机制，引起相似的RNA代谢改变。所以，TDP-43平衡状态是维持正常细胞功能的关键因素。该蛋白过表达和缺失均可成为ALS疾病的致病原因。

TDP-43纯合全身敲除小鼠出现胚胎致死表型 ，杂合子敲除小鼠可存活，但老年小鼠出现运动障碍迹象。为了探索TDP-43蛋白在中枢神经系统及ALS作用机制，有研究者利用朊病毒启动子（PrP) 表达A315T突变体或野生体TDP-43蛋白，构建广泛神经系统表达的转基因小鼠。该研究表明，Prp-TDP43A315T转基因小鼠出现进行性致命神经衰退性疾病。虽然突变基因表达整个神经系统，但泛素化蛋白沉积的病理学聚集变化集中在特殊神经元细胞，包括额叶皮层锥体与脊髓运动神经元，但却未见细胞浆TDP-43聚集。提示DNA/RNA结合蛋白功能改变，而不是毒物聚集，导致了神经衰退性变化。

然而，后来的进一步研究发现，TDP-43A315T小鼠模型并未表现令人信服的ALS样肌肉神经功能缺陷表型，而突变小鼠早期死亡是与胃肠(GI)功能损伤有关。表现为进行性胃肠蠕动性降低，最终导致GI运动停止。 所以，目前认为，TDP-43A315T突变小鼠疾病模型可能适合研究胃肠道神经退行性表型，但并不适合ALS疾病的药物临床前评价验证研究。

中国实验动物信息网：如何构建与选择理想合理的小鼠疾病模型？

俞晓峰：ALS小鼠疾病模型用于药物临床前评价研究转化效率低的经验教训，也让我们思考一个非常重要的问题，即如何构建与选择合理且理想的小鼠疾病模型，以提升其在药物研发研究中的临床转化价值与预测性。过去的失败经验已经告诉我们，如果选用了不适合或不准确的小鼠疾病模型，或小鼠体内实验设计不合理等，由此获得的临床前实验结果预测价值，则会大大降低。

让我们以ALS小鼠疾病模型研究相关实际案例，进行进一步深入的解析。回顾分析ALS小鼠疾病构建历程，即从起初的SOD1突变转基因小鼠，到后来报以极大热情TDP43新突变小鼠疾病模型的发展过程。现在已经清楚，SOD1突变小鼠疾病模型并不能完全模拟人ALS疾病的所有特征，特别是缺乏该疾病诊断的典型特征，即SOD1患者大脑皮层运动神经元衰退与损失表型，显示了小鼠与人在运动皮层神经退行性变性方面的差异。还必须清楚一点的是，实际上，此类SOD1突变体转基因疾病模型的建立，需要依赖该突变基因较高水平的过表达，才能诱发ALS疾病发生。而且，野生型人SOD1基因过表达，也可以诱发小鼠相应的神经退行性改变。因此，有理由认为，过表达SOD1基因本身，足以诱发该疾病常见表型。

临床上有超过50%ALS患者，同时伴有额颞叶痴呆（FTLD），而SOD1突变小鼠则未见此表型。提示人与小鼠SOD1致病过程可能存在不同致病通路。所以，由该SOD1小鼠疾病模型研究获得的转化预测价值，也就可想而知了。另外，与其他ALS致病基因比较，SOD1基因本身，并不具备其独特ALS疾病表型，因此，在不同ALS疾病相关基因下游，有可能存在共享的致病通路。

PrP-TDP-43-A315T人突变小鼠是最早构建的TDP-43转基因小鼠模型，该转基因小鼠在3个月后，出现体重下降与行为相关等表型，并约在153天左右开始死亡。起初的研究表明，约20%脊髓运动神经元损失，到约50%的皮层脊髓束轴突损失的发展过程。也有研究分别构建了人突变PrP-TDP-43-A315T和人野生型PrP-TDP-43转基因小鼠模型，且均有超过4倍表达量增加。这些TDP-43转基因小鼠都表现有存活时间缩短表型，且存活期长短与突变基因拷贝数负相关。而所有野生型TDP-43转基因小鼠，却未见早期死亡现象。

然而，需要告诫的是，在仔细分析该研究后发现，其实研究中构建的两个过表达转基因小鼠模型（突变与野生型），TDP-43基因的表达量是有一定差异的，即野生TDP-43基因表达量较突变TDP-43基因表达略低，所以，以前研究中观察到TDP-43突变小鼠与野生型小鼠的某些表型差异现象，可能是因为转基因表达量差异所致。而且，如此的分析推论也得到另一个实验研究结果的间接证实，该研究分别通过比较突变TDP-43-M334V和野生型TDP-43两种转基因小鼠模型发现，两种小鼠（突变与野生型）基因表达量相似（均为～3倍增加），且未见两种小鼠在疾病发生严重程度方面有差异。提示TDP-43基因表达水平的改变，而不是基因突变特征本身，是诱发小鼠疾病表型的原因。并且，对TDP-43突变小鼠进一步分析研究也发现，该转基因小鼠死亡表型，并非由运动神经元功能损伤，导致运动神经元衰退变化，而是由胃肠道功能破坏所致。

由于转基因小鼠模型构建技术本身的特点，也使该类小鼠疾病模型研究结果的分析与解释，变得更为复杂。因为应用这种转基因小鼠研究中获得的研究结果，是很难将人TDP-43过表达与小鼠内源性tdp-43功能完全区分开来。而且，想要在人TDP-43转基因小鼠中，实现转基因过表达水平控制在接近ALS患者观察到表达水平，也是相当困难。实际上，有一些ALS患者不仅含有突变TDP-43蛋白，同时也见有另外ALS致病基因，比如C9ORF72基因突变同时出现的现象，而作为ALS致病基因C9ORF72，也可能引起运动神经元受损的特殊病理学改变。

ALS小鼠疾病模型构建策略与方法的不同，可直接影响到疾病基因拷贝数及表达量等，从而影响到疾病的表型特征与严重程度。比如，已知SOD1G93A转基因小鼠插入的人突变基因可高达25个拷贝数，表现有快速进行性运动神经元衰退的严重损伤，有研究表明，低拷贝数（～8-10拷贝数）的人SOD1G93A转基因小鼠品系，出现瘫痪症状时间约在24～34周鼠龄时候，明显晚于高拷贝数（～25拷贝数）转基因小鼠。如果突变和野生型SOD1转基因小鼠表达量相似，同样也有相似的神经学相关表型结果，说明小鼠疾病表型，包括早期轻度瘫痪迹象的脊髓空泡化，甚至运动神经元衰退损失等，可能不是因为突变基因引起，而更可能是因为基因的过表达所致。关于首个报道的ALS小鼠疾病模型，即SOD1G93A突变转基因小鼠模型，几乎都没有研究基因插入位点信息。幸运的是，到目前为止，还未见关于SOD1G93A转基因的随机插入，造成对已知基因破坏的报道。

因此，如何构建理想的突变转基因小鼠模型，实现转基因表达水平与小鼠内源性基因表达水平相似，以排除可能因为基因过表达本身引起的非特异性作用，目前的实际操作难度却相当大。因为转基因小鼠构建常常用到外源启动子，确保转基因在特定组织中高表达。而如此异位表达，又可能引起新的非特异性表型。比如，TDP-43A315T转基因小鼠是应用朊病毒启动子（Prp），虽然该启动子具有神经元强活性，但也广泛表达在其他组织细胞类型，可引起小鼠意外早期死亡，而死亡原因是由于肠道神经退行性病变，而非运动神经元损伤所致。     

与随机转基因小鼠模型比较，基因定点插入小鼠模型，则具有病程进展较慢，且表型出现也较轻的特点，这可能与研究蛋白表达水平相对较低有关。但基因定点插入小鼠模型保留了基因正确时空表达水平，避免了一些蛋白因为过表达诱发的非特异性毒性作用，有助于在小鼠生命周期内，研究基因/蛋白与其作用靶标分子间的相互作机制。也有关于ALS小鼠疾病模型的基因定点插入的相关研究报道，比如，将含全人TDP-43 BAC（包括基因内含子和调控序列）插入小鼠Roas26位点，建立ALS小鼠疾病模型。该小鼠表现为人TDP-43低水平表达，只有轻度年龄依赖相关的运动功能障碍表型。另外，TDP-43Q331K突变定点插入小鼠模型，表现有TDP-43增加毒性功能,  即该基因出现剪切改变和蛋白自我调控功能障碍，导致额颞叶痴呆出现，虽然该小鼠模型并未表现包含体或者运动神经元损失表型。一般而言，这类定点插入的小鼠疾病模型，出现表型较慢也较轻，因而有利于揭示疾病症状出现的早期特征，有助于寻找早期生物标志物。当然，表型出现较晚，自然增加了相应研究成本。尽管如此，定点插入小鼠疾病模型，为研究疾病发生早期阶段，提供了充裕的研究窗口期。

相反, 转基因小鼠疾病模型，则常引起明显表型和显著运动神经元损失变化，使其成为疾病晚期过程相关研究的潜在选择。应用小鼠Prp启动子构建的TDP-43Q331转基因小鼠模型，不仅表现有运动神经元损失，也出现肌肉退行性改变和伴有运动损伤的神经肌肉结合损伤，但这些表型的出现，都与该基因过表达密切相关，呈现TDP-43表达的明显计量-效应依赖毒性作用。

如何定义好的小鼠疾病模型。首先，必须真正了解研究者感兴趣且需要的小鼠疾病模型，然后，才是寻找最为合适或更好的小鼠模型开展研究，并建议尽量选择不同策略及技术构建的小鼠疾病模型，开展疾病特征研究。比如，针对ALS小鼠疾病模型，需要了解研究目的是为了关注早期微小的脊髓运动神经元的变化？还是揭示上下神经元的损伤死亡？或者研究神经胶质细胞所发挥的作用等？

如何选择合适且理想的小鼠疾病模型。评价与选择是受诸多因素的影响。而关键考虑要素是小鼠疾病模型的设计策略，即小鼠疾病模型是如何设计与构建的，比如，是应用转基因随机过表达策略，还是定点/原位插入策略等。当然，研究者需要仔细分析研究小鼠疾病模型表型特征及其影响因素，期望能与对应人疾病表型特征及影响因素相似，比如，性别、年龄与遗传背景等，因为这些都是影响疾病表型特征的重要因素。总之，合适的小鼠疾病模型需要至少满足以下几点：1、能够准确模拟人相关基因特定功能与疾病特征，这是小鼠疾病模型应用于药物临床前评价研究最为重要的基石。2、有较高的研究结果出现频率，使其成为可靠科学研究的有力证据支持。3、可被重复验证，易被其他研究者使用，促进该研究领域发展进步。4、可被广泛应用，小鼠模型适合其他不同动物设施饲养与繁育等。

在选择小鼠疾病模型进行药物临床前研究的时候，建议参照如下步骤进行：1、确定研究疾病目的；2、了解影响疾病发生的内在与外在因素；3、查阅已有的相关小鼠模型综述文献；4、收集研究疾病的生物学信息资料；5、明确研究疾病的独特资源；6、确定小鼠疾病模型的初步选择；7、开展小鼠疾病模型初步研究；8、分析小鼠疾病模型研究初步结果与生物学信息资料等相关知识间的差距；9、评估小鼠疾病模型初步应用研究的有效性；10、明确小鼠疾病模型的最终选择。

中国实验动物信息网：影响药物临床前研究结果预测有效性的因素？

俞晓峰：药物研发的临床前评价研究中，除了选择合适且理想的小鼠疾病模型外，还应该清醒意识到，有许多因素可以直接影响的实验结果转化有效性。还是以ALS中枢神经系统疾病损伤研究为例，小鼠年龄、性别和环境等也是重要的影响因素。不同物种品系都有自己独特寿命、组织特异细胞生命周期、氧化应激反应、以及基因表达谱特征等，而这些特征都与年龄相关，可直接影响到年龄相关疾病进程的差异。

年龄与ALS关系也受到环境因素影响，比如，饮食和紧张压力等。不同动物饲养环境及研究课题组会有不同动物种群品系的繁育管理体系与方法，产生对动物紧张压力和行为反应的不同影响。性别是ALS的危险影响因素，雄性较雌性更倾向发生ALS疾病，雌性ALS小鼠模型相对活得也更长。

虽然，人与小鼠的基因组有接近98%的相似性，但在DNA甲基化或组蛋白修饰等表观遗传学方面，却存在明显物种差异，从而影响到基因表达的可变性。物种间器官组织系统的解剖学和生理学不同，比如人与小鼠大脑解剖学上的显著差异，也会影响到ALS疾病表型（中枢神经系统和骨骼肌）的差异及药物反应。

如何提高小鼠疾病研究转化效率。也是药物临床前评价研究面临的挑战。过去10多年来，在有十几个ALS治疗药物临床前动物试验中，都表现有缓解ALS疾病表型效果，但进入人体临床试验，最终只有一个成功。药物临床试验失败率超过80%。  

美国ALS治疗发展研究所（TDI）曾经对超过100个ALS潜在治疗药物，重新应用ALS小鼠疾病模型进行验证实验发现，许多以前在该小鼠疾病模型上验证有效的药物，却多在该研究中无效。我们现在已经知道，TDP-43突变小鼠疾病所表现的疾病病理特征与临床患者有明显差异，比如ALS患者时间伴随的进行瘫痪表现，而TDP-43突变小鼠疾病模型未出现。并且，小鼠疾病模型的步行与抓力强度等反映肌肉损伤改变也只是呈轻度变化，小鼠最终死亡是因急性肠道平滑肌损伤引起的肠道运动障碍，而非进行性肌肉衰退所致。因此，虽然该TDP-43突变小鼠疾病模型，可以用于药物作用相关疾病机制性方面的研究，但却难以胜任针对延长ALS患者寿命的药物临床前评价研究。

该ALS TDI研究结构还通过对过去4年近5500只用于ALS药物治疗组与对照组SOD1小鼠，进行大量而系统研究分析发现，所有小鼠都显示SOD1基因特定突变型。几乎90%SOD1突变小鼠的寿命为134天左右（前后相差10天时间左右）。然而，在仔细分析小鼠相关资料情况后，提出了4个可能影响小鼠寿命长短的干扰因素。这里需要特别强调的关键点是，这些影响小鼠寿命长短差异的4个干扰因素，是经过对上百只多代小鼠的仔细检测分析，才能被挖掘观察到的。比如，小鼠疾病模型研究中，有没有将与研究疾病无关的死亡小鼠剔除？有没有考虑小鼠性别因素？有没有将同窝小鼠分开至实验治疗组和对照组等？因为SOD1雄性小鼠的疾病症状出现时间及死亡发生较雌性小鼠约早一周时间。如此一周时间，就是4%生存变化差异，很容易在药物效果评价中被误解。再有，就是小鼠疾病模型构建策略的关键问题，即小鼠引入突变基因的拷贝数是多少？这些随机重复插入的基因，通常并不是按生殖细胞分裂稳定传递至下一代的，因此，需要对繁殖小鼠进行常规而持续检测鉴定，以确保繁殖后代小鼠转基因拷贝数没有减少，从而防止可能导致小鼠疾病症状减弱的自发性现象。

所以，关于如何降低小鼠药物临床前实验研究中，可能出现结果假阳性问题，研究者建议如下：1、排除实验中无关小鼠，比如实验结果中，应该去除因错误操作而造成的与疾病不相关的小鼠死亡; 2、平衡小鼠性别，因为雄性与雌性在疾病症状表现方面有差异，从而可能干预了温和药物的治疗效果; 3、 分开同窝后代小鼠到实验组，因为将同窝后代小鼠放入同一实验组，可引起实验结果偏差; 4、确保研究基因表达及活性，因为引起疾病发生的基因，常常不能稳定可靠遗传。如果插入基因拷贝数丢失，小鼠疾病症状严重性会减弱，药物效果也会随之表现较其本身更加有效。

应用ALS小鼠疾病模型开展转化医学研究，还应考虑到影响药物临床前实验研究结果的其他因素。比如，ALS小鼠疾病模型实验研究的评价方法，多以定性检测分析，且受主观影响较大评价方法为主，包括握力强度、吊挂时间、步态分析，以及神经学分数等。如此缺乏客观定量检测分析评价方法，不利于不同实验研究结果的分析比较。 另外，目前的药物临床前评价研究，多缺乏随机分组及非双盲法操作原则，自然也影响到实验结果的客观与完整性。特别需要提醒的是，转基因小鼠模型是建立在近交系上，具有遗传背景同质化特点。而临床ALS患者则都具有多样化的特征。而且，目前的药物临床前评价实验研究，多在疾病症状出现之前，就开始测试了，这也完全有别于实际临床药物试验研究。因此，对于哪些临床上需要患者疾病症状出现后，才使用药物治疗的临床试验，小鼠实验研究中预先给药的实验设计策略与操作，明显缺乏充分理由的。

因此，分析影响ALS药物临床试验失败的可能原因，除了ALS小鼠疾病模型构建策略与方法本身的原因，以及上面介绍的其他影响因素，也有可能是临床试验设计方面的缺陷，包括药物治疗时间选择，剂量，患者数量与选择等。另外，临床研究设计能否真正解答相关问题，比如，有效药物剂量能否抵达作用靶点？ 药物的非特异性作用是否有可能影响其有效性？药物作用靶点是否真正反映了疾病致病机制过程特征等？  

当然，小鼠与人在许多存在的差异，包括解剖学上、代谢免疫学上、中枢神经系统与肠道微生物学组成上，以及实验小鼠的近交系特征等，都让我们意识到，小鼠疾病模型与人疾病是存在差异的，不可能完全模拟人疾病致病过程特征。

因此，为了提高小鼠疾病模型转化可靠性与预测性，也是科学家们一直在努力探索与追求的目标。基于前面介绍的小鼠疾病模型在药物临床前评价研究中的成功应用及其经验教训，科学家们也在不断强调选择正确合适的小鼠疾病模型的重要性与紧迫性，强调不同小鼠疾病模型构建策略与方法特征及其实际应用意义，以及小鼠疾病病理学及症状‍表型特征是否与人相关疾病相似或接近等。必须严格控制药物临床前研究中可能的影响因素，包括小鼠遗传品系、性别年龄组成、饲养环境、动物遗传漂移、肠道微生物组成等；警惕基因条件修饰小鼠模型研究中，应用不同Cre小鼠可能引起的非特异性毒性作用，以及诱导剂Tamoxifen本身可能的毒性作用影响等。

将小鼠疾病模型临床前研究结果有效转化至人相关疾病研究与临床治疗应用，是生物医药研究领域共同奋斗努力的目标。然而，我们必须清楚，小鼠疾病模型毕竟还只是动物模型，有其本身的局限性。但是，应用小鼠疾病开展药物临床前评价研究，已经/也并将继续对生物医药领域研究发展，发挥着极其重大而深远的促进作用。