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点突变细胞模型的构建方法

2023年03月24日来源：赛业生物作者：校审李意祥责任编辑：lascn

摘要：构建细胞点突变细胞模型时的理论基础是基因的同源重组修复。当细胞基因组DNA双链由于外部因素而断裂时，细胞中存在着的DNA修复机制就会被激发，对断裂位点的DNA双链进行修复，根据修复方式的不同可分为同源重组修复和非同源重组修复。

全球有超过50,000种人类相关的遗传疾病，其中大部分是由基因组的点突变（point mutation, PM）引起的。而对于罕见病而言，80%是由基因缺陷引起的，同时这些基因缺陷中点突变又占了60%。研究表明，点突变能使人类对癌症、听力疾病、精神病等多种疾病的易感性增加。

研究点突变相关遗传疾病，免不了要构建细胞模型。点突变细胞模型可以直接研究细胞信号传导、代谢和分化等机制，是研究基因功能和调控、癌症、遗传疾病等生物学和医学问题的重要工具，具有精确模拟基因变异、可控性高、安全省时等优点。

点突变细胞模型的构建

构建细胞点突变细胞模型时的理论基础是基因的同源重组修复。当细胞基因组DNA双链由于外部因素而断裂时，细胞中存在着的DNA修复机制就会被激发，对断裂位点的DNA双链进行修复，根据修复方式的不同可分为同源重组修复和非同源重组修复。顾名思义，同源重组是指DNA在修复的过程中以同源的DNA序列作为模板完美修复，而非同源重组修复是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，同时可能会随机引入新的碱基。

DNA双链断裂修复途径。（A. 同源重组修复，B. 非同源重组修复）

根据这个理论基础，点突变细胞模型的构建分为三个部分：

1.定点切割DNA

由于在自然界中DNA的断裂是随机的、不确定的，因此我们需要人为定点对DNA产生切割。在这个过程中，CRISPR-Cas9技术给我们提供了极大的便利。我们可以通过人为设计sgRNA，并将Cas9蛋白与sgRNA一起转染到目的细胞中。在sgRNA的引导下，Cas9蛋白对靶位点处的DNA进行切割，产生DNA双链断裂。

2.同源重组修复DNA

我们通过CRISPR-Cas9技术使细胞内的基因组DNA产生了双链断裂后，同时引发了细胞内的DNA修复机制。因此，为了使DNA在修复过程中能通过同源重组的方式修复DNA并引入突变位点，我们需要为细胞提供额外的同源修复模板。这个模板的本质是人为合成的DNA序列，由5’端同源臂、突变位点和3’端同源臂组成。值得注意的是，这种同源模板序列是随sgRNA和Cas9蛋白一起转染进细胞的。

3.阳性细胞筛选

这部分是细胞模型构建的关键部分。试想下，我们通过细胞转染技术将CRISPR-Cas9系统和模板DNA序列转入细胞中后，由于细胞内部机制的作用，我们得到的细胞池中既包含纯合子阳性细胞和杂合子细胞，又包含没有发生碱基突变的野生型细胞。那么，我们该如何挑选出目的细胞呢？对于点突变模型来说，由于没有引入抗性基因，常用的方法便是通过稀释法将细胞池的细胞稀释转移到96孔板中，形成单克隆细胞，然后收集单克隆细胞进行大量测序，以得到预期的纯合子细胞。

点突变细胞模型推荐

由于人类疾病中基因产物并非总是如转基因一样的高表达，也不是像基因敲除一样完全不表达，很多情况下只是因单个或者少数几个碱基的改变而造成的蛋白结构改变，表现为非正常激活或抑制。因此，构建精细的、与疾病对应的点突变细胞模型便成为了疾病临床前研究的最佳方案，而CRISPR-Cas9技术则使得我们能够以更低的成本和更高的效率实现这一目标。

经大量测试和实验工艺优化，赛业生物开发了Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统，实现更深度的基因信息分析和更合理的gRNA设计。基于该系统，我们能提供准确快速的点突变细胞模型构建服务，通过优化的α-donor体系将人源化的Cas9蛋白、gRNA和donor三组分转染至目的细胞，产生高效同源重组，实现纯合子交付，快至八周。现在下单，HEK293T、A549、HCT 116、HEK293等多种细胞的点突变项目均可享受3.98万的优惠价格。