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疾病与药物研究

德克萨斯大学研究团队Nature子刊发文，揭示不依赖配体的STING信号激活

2023年04月10日来源：赛业生物作者：校审李意祥责任编辑：lascn

摘要：cGAS-STING通路是人类先天免疫系统中的关键组成部分，在感染、癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病中发挥着重要作用。通常认为cGAS-STING通路的激活是一种“触发-释放”机制，也就是说在检测到微生物DNA或环状二核苷酸时激活，引发I型干扰素（IFN）反应。若没有致病配体存在，这一通路是否会被激活，目前还不大清楚。

cGAS-STING通路是人类先天免疫系统中的关键组成部分，在感染、癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病中发挥着重要作用。通常认为cGAS-STING通路的激活是一种“触发-释放”机制，也就是说在检测到微生物DNA或环状二核苷酸时激活，引发I型干扰素（IFN）反应。若没有致病配体存在，这一通路是否会被激活，目前还不大清楚。

近日，德克萨斯大学西南医学中心团队深入分析了稳态下的cGAS-STING信号传导。研究者发现，STING在稳态下不断从内质网转运到高尔基体，之后继续转运到溶酶体。若从高尔基体到溶酶体（即后高尔基体）的转运被中断，则会延长STING在高尔基体的停留时间并激活IFN信号。

这项研究成果发表在《Nature Communications》杂志上，提出了一种不依赖配体的cGAS-STING信号的“本底流动”机制，可在后高尔基体转运水平上进行调控，并有望应用于癌症免疫治疗。

图片来源：Nature Communications

（https://doi.org/10.1038/s41467-022-33765-0）

研究材料与方法

在这项研究中，研究人员使用了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），通过siRNA敲低了多个基因的表达，并利用CRISPR/Cas9技术生成了基因敲除细胞系。研究者还使用了多种基因敲除小鼠，其中Gcc2^+/−和Rab14^+/-小鼠由赛业生物提供。除了敲除后的基因表达分析，研究者还采用荧光共聚焦显微镜观察了STING的转运过程。

技术路线

01 中断STING的后高尔基体转运会选择性激活IFN信号

02 转运中断导致STING在高尔基体内长时间停留，导致IFN信号增强

03 基因敲除分析证实，STING的后高尔基体转运由GCC2和Rab14等辅因子调控

04 Gcc2和Rab14的敲除可诱导抗肿瘤免疫力，并抑制小鼠的肿瘤生长

研究结果

1.GCC2调控了STING的高尔基体排出

为了全面分析STING转运过程中的所有主要细胞器上的辅因子，研究人员建立了一张候选辅因子的空间图，并通过siRNA敲除对其进行功能验证。在不依赖配体（tonic）的激活分析中，研究者发现，选择性中断高尔基体排出（Golgi-exit）或后高尔基体（post-Golgi）的囊泡转运会意外地激活先天免疫信号。

研究者之后比较了有代表性的内质网辅因子SEC24C和后高尔基体辅因子GCC2。GCC2是一种参与后高尔基体囊泡分拣的卷曲螺旋蛋白，以往没有与STING信号通路相关联。

与对照组相比，野生型MEF中Gcc2的敲低明显增加了干扰素基因Ifnb1和干扰素刺激基因Ccl4的本底表达，而Sec24c的敲低则没有影响。共聚焦显微镜分析显示，Gcc2敲低破坏了高尔基体排出，导致DNA刺激后STING在内质网和高尔基体中积累。这些结果表明，STING的高尔基体排出是由GCC2及其他后高尔基体辅因子调控的。

为了进一步分析GCC2的功能，研究人员利用CRISPR/Cas9技术生成了Gcc2^KO MEF。与Gcc2^WT MEF相比，Gcc2^KO MEF中的IFN基因和干扰素刺激基因（ISG）的本底表达增加。在HSV-1-GFP感染后，Gcc2^KO细胞产生了更高水平的IFNβ，且病毒复制和病毒滴度下降（图1）。这些数据证实，GCC2是STING信号传导中一个重要的负调控因子，在静息状态和配体刺激后，它都能介导STING从高尔基体转运到溶酶体进行降解。

利用定量延时共聚焦显微镜来分析STING转运后，研究者发现在Gcc2^KO细胞中，STING在高尔基体的停留时间与Gcc2^WT细胞相比明显增加，而且STING激活的关键标志物（p-TBK1和p-IRF3）活性更高，这表明STING在高尔基体的长时间停留招募了更多TBK1和IRF3并磷酸化，从而增强IFN信号（图1）。由此可见，GCC2调控了STING高尔基体排出，而Gcc2^KO同时增强了不依赖配体和依赖配体的STING信号传导。

GCC2是STING的高尔基体排出所必需的^[1]

以往的研究发现，将细胞培养温度从37°C降低到20°C可以减缓高尔基体的囊泡转运，那么这是否会增强STING信号？研究人员发现，与37°C培养的细胞相比，在20°C下培养的细胞表现出显著增强且更持久的STING信号传导活动，且STING在高尔基体中停留的时间明显延长。这些数据进一步支持了高尔基体排出是减弱STING信号传导的一个关键检查点。

2.cGAS驱动不依赖配体的STING转运

之后，研究人员探索了Gcc2^KO细胞中的STING转运和信号传导是由什么驱动的？研究者发现，Gcc2^KO细胞的先天免疫激活离不开cGAS和STING。通过突变分析发现在Gcc2^KO细胞中，cGAS的DNA结合和酶活是细胞固有的先天免疫激活所必需的，而cGAMP结合和STING磷酸化也是必不可少的。进一步分析显示，Gcc2^KO通过中断转运来增强STING信号，而没有进一步激活cGAS。利用cGas^-/-小鼠组织开展的分析显示，cGAS在稳态下正常运作，它促进STING信号传导，以维持免疫防御的本底状态。

3.RAB14等蛋白介导STING的后高尔基体转运

以往发现，在“货物”运出高尔基体后，不同的Rab GTP酶会“盖上邮戳”，分拣到不同的目的地。那么，在STING的转运过程中，哪些Rab负责“盖邮戳”？研究者发现，STING与多个Rab有着强的相互作用，包括Rab2b、Rab6b、Rab9a和Rab14。

其中，在敲低Rab14后，几种ISG的本底表达明显升高（图2）。与Rab14^WT MEF相比，Rab14^KO MEF中的STING蛋白水平更高，且STING在高尔基体中的停留时间增加。Rab14^KO与Gcc2^KO的表型相似，这表明由Gcc2-Rab14调控的STING高尔基体排出对免疫信号传导至关重要。

RAB14及其他Rab介导了STING的后高尔基体转运^[1]

4.Gcc2^KO和Rab14^KO诱导抗肿瘤免疫力

接下来，研究人员开展体内分析，以评估中断STING后高尔基体转运的生理后果。Rab14^−/−小鼠是胚胎致死的，因此实验在Gcc2^−/−小鼠身上开展。6个月大的Gcc2^−/−小鼠对各种自身免疫性疾病的常见抗原的IgM自身抗体水平明显升高。重要的是，Gcc2^−/−Sting^−/−小鼠的这些自身抗体则完全恢复到野生型水平。由此可见，Gcc2缺乏会在小鼠中诱导STING依赖性的自身免疫。

STING信号的激活会诱导抗肿瘤免疫力，于是，研究人员敲除B16黑色素瘤细胞中的多个STING转运辅因子，并将其植入野生型小鼠体内。三个后高尔基体辅因子的敲除（Gcc2、Rab14和Npc1）都抑制了肿瘤生长。Gcc2^KO和Rab14^KO B16肿瘤的生长速度明显慢于野生型B16肿瘤。这些数据显示，在后高尔基体步骤中中断cGAS-STING的本底流动可以实现抗肿瘤免疫，在功能上与STING激动剂相似。

研究结论

整体模型的示意图^[1]

总的来说，这项研究揭示了STING在稳态下不断从内质网转运到溶酶体，而不是静止在内质网上。若后高尔基体的转运被中断，无论是通过敲除转运辅因子还是通过降低温度，都会延长STING在高尔基体的停留时间，并增强IFN信号（图3）。作者认为，与“快速而猛烈的”STING激动剂相比，这种转运中断也许是激活STING的另一种“缓慢而稳定的”模式，在癌症免疫治疗中可能会带来更有利的结果。

原文检索：

[1] Tu, X., Chu, TT., Jeltema, D. et al. Interruption of post-Golgi STING trafficking activates tonic interferon signaling. Nat Commun 13, 6977 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33765-0

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Gcc2 KO小鼠