一、实验原理

同工酶是指那些催化功能相同，而分子构型不同的酶。酶蛋白分子的不同，反映了为它们编码基因的DNA的碱基顺序不同。利用凝胶区带电泳可以将不同的同工酶分离，并利用特异底物染色法使它们在凝胶上显示出迁移率不同的活性区带。这样基因的产物就直接反映出来了。比较亲代与子代的酶带，就可以对控制它们的基因进行遗传分析。如同其他的形态标记，同工酶作为生化遗传标记已广泛应用于基因作图、发育遗传学、群体遗传学、分类学等多个领域。同工酶电泳分析是一种重要而用途广泛的分子生物学方法。

二、实验目的

1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同工酶的技术

2.了解黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）酯酶同工酶Est-6的遗传方式

3.学习重组值的估计方法

三、实验材料

黑腹果蝇的三个品系：野生型（wildtype）、残翅（vestigialwing）、黑檀体（ebonybodycolor）

四、实验器具和药品

直流稳压电泳仪（VIW-Ⅱ型），垂直平板电泳槽，磨口梨形真空抽气瓶，0.2毫升玻璃匀浆器，50微升微量注射器，离心机（3500转/分），吸管，培养大指管，毛笔，麻醉瓶，小镊子，瓷盘。

试剂配制：

1.凝胶组成液：

a、Tris-柠檬酸缓冲液：Tris15克、柠檬酸1.25克用蒸馏水溶解，调pH=8.9，定容至1000毫升。

b、丙烯酰胺24克，用a液溶解，定容至100毫升。

c、甲叉双丙烯酰胺0.75克，用a液溶解，定容至100毫升。

d、乙二胺四乙酸二钠0.187克，溶于15毫升a液中。

e、四甲基乙烯二胺原液。

f、过硫酸胺0.4克，溶于10毫升蒸馏水中。

g、丙烯酰胺10克、甲叉双丙烯酰胺2.5克，溶于蒸馏水中，定容至100毫升。

2.电极缓冲液：

Tris6.2克、甘氨酸2克，溶于100毫升蒸馏水中，pH=8.7，用时稀释50倍。

3.样品匀浆液：

蔗糖1.5克，溴酚蓝0.01克，Triton×1000.05克溶于10毫升蒸馏水中。

以上溶液全部放入冰箱，0—4℃保存。f液用新鲜配制的或贮存期二周内的。其他溶液均可贮用二个月。

4.染色缓冲液（0.1mol/L磷酸缓冲液）：

14.2克磷酸氢二钠溶于水中，用2mol/LHCl调pH至

6.5，定容至1000毫升。

5.底物溶液：α-萘乙酸1克、β萘乙酸0.25克，溶于25毫升丙酮内

6.脱色固定液：

水∶甲醇∶冰醋酸=5∶5∶1

五、实验说明

1、黑腹果蝇的酯酶-6（Est-6）酶带有三型，一型是仅有一条迁移率较大的酶带，这酶带在凝胶上泳动较快，称为F带，另一型仅有一条泳动较慢的带，这酶带称为S带，第三型是有两条酶带，一条F带和一条S带。实质上三种表型是由Est-6^F与Est-6^S一对等位基因的组合不同决定的（参见图8-1）。前二型分别是纯合体Est－6^F/F和Est－6^S/S，而第二型是杂合体Est-6^F/S。

2.Est－6酶带在蛹期不显示，成虫刚刚羽化时也不显示，所以作电泳分析时，如为新羽化的成虫，应转入另一培养瓶中饲养二天以上，方能清晰地显示Est-6酶带。

3.本实验采用聚丙烯酰胺凝胶薄层（1mm）垂直平板电泳，具有较高的分辨率，可将带有不同电荷的酶蛋白分子分开，并且聚丙烯酰胺凝胶具分子筛的作用，也可将分子构型，大小不一的酶蛋白分子分开。由于在同一块凝胶上、同一条件作多个样品的分析，所以便于比较。

4.凡含丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺的溶液均有神经性毒，慎勿沾于皮肤及粘膜上。

六、实验步骤

1.将野生型、残翅、黑檀体三个品系的果蝇分别作单对交配，即将单只处女蝇和单只雄蝇放入同一培养大指管中。放若干管。待一周后将产完卵的亲本果蝇移出。

2.对移出的亲本果蝇作Est-6的电泳分析，步骤如下（参见图8-2）：

（1）吸取a液4.9毫升、b液3.75毫升、c液3.35毫升、d液0.325毫升、e液25微升混匀，置梨形真空抽气瓶中抽气3—4分钟，加入f液0.125毫升摇匀，慢慢倒入大小为16×15×0.1cm的垂直板电泳槽的二块玻板间。玻板二边和底部预先以a液配的1％琼脂糖凝胶封住。倒入后要求一无气泡、二不渗漏。随

即以吸管铺上1-2厘米高的水层，这样凝胶聚合后，面上可呈水平。

（2）在室温下经20分钟后，凝胶与水层间出现折光不同的界面时，说明凝胶已聚合。倒去水层，用滤纸吸尽余水。该层为分离胶。

（3）吸取a液2.95毫升、g液1毫升、e液5微升、f液0.05毫升，混匀后倒入分离胶上部，然后插上样品梳。过30分钟后即聚合，该层为浓缩胶。小心抽出样品梳，这样在浓缩胶面上就留下间隔开的加样槽。用滤纸条吸净加样槽内残存的溶液。上下电泳槽分别注入电极缓冲液。

（4）凝胶聚合时间可进行样品处理。将记录好形态特征的待分析果蝇置于编好号的0.2毫升玻璃匀浆器中，加入15微升样品匀浆液，在冰浴中匀浆。匀浆完毕，置离心机中，以3500转/分离心三分钟。

（5）以微量注射器吸取上清液10微升，加入加样槽内，针头接近槽底，慢慢注入，防止扩散。

（6）在4℃冰箱内以300伏特电压开始电泳，方向从负极到正极。当溴酚蓝进入分离胶后，可将电压提至450伏特，大约2.5小时后，溴酚蓝到达底部标线处，即可结束电泳。

（7）撬开玻板，小心取下凝胶，投入染色液中，染色液以染色缓冲液30毫升，坚牢蓝RR10毫升，底物溶液1毫升组成。室温下20分钟后酯酶同工酶带已清晰显示，其中紫红色醒目的即为Est－6酶带（参见图8-1）。

（8）取出凝胶用水冲净后投入脱色固定液中漂洗过夜。脱去底色后，酶带更为清晰。可制成干片永久保存，或浸清水内，经常换水，足供一年观察。

3.选出雌蝇和雄蝇的Est－6表型均为F带或S带的纯合子的培养指管，该类培养指管出来的子代即可留作为F带纯合子或S带纯合子。

4.作不同品系间不同纯合子间的交配。正反交都可以，但母本须用处女蝇。每只指管放2—3对。

5.一周后将亲本移出。待F代出现后，移入新的培养指管中，每管放2—3对。此时雌蝇无须处女蝇。

6.一周后将F₁移出，观察表型，并进行Est－6电泳分析。

7.F₂代成虫出来后，移入新的培养指管饲养二天以上后，取出麻醉，区别表型，再作Est－6电泳分析。约7—8天成虫基本上可统计完毕（以上实验步骤可参见图8－3）。

七、实验结果统计

按下列表格记录实验中每个交配组的数据。

果蝇Est－6遗传分析实例

1.从A和B二组交配来看，Est－6表型均为F/S，可见Est-6^F与Est-6^S这一对等位基因是共显性的。

按孟德尔分离定律，F²时形态标记应作3∶1分离，即A组野生型∶残翅=3∶1；B组野生型∶黑檀体=3∶1。而F²时Est－6应分离为三型，即F∶F/S∶S=1∶2∶1。下面是实验结果和相应的x²测验：

2.将Est-6与形态基因同时考虑，看二对基因在F₂是否符合孟德尔的自由组合定律：

A组：F₁♀+/vgEst－6^F/S×F₁■＋/vgEst－6^F/S

如果这两对基因是自由组合的，按棋盘格法配列，应得如下结果（见下页）。

归纳棋盘格内各基因型，并根据显隐性关系，可得到F₂的

表型比为：［＋，F］∶［＋，F/S］∶［＋，S］∶［vg，F］∶[vg，F/S]：[Vg，S]

这里［＋，F］表示野生型，F带，其余类推。现在根据表型比例求出A组实验的预期数与实得数比较进行x²测验。

得到的x²值为9.11，自由度为5，查x²表，得P=0.20—0.10，所以可以认为有关那对性状的F²分离是符合独立分配的。从而我们就决定这两对性状的基因位于不同的染色体上。

B组的交配方式为：F1♀＋/eEst-6^F/S×F₁■＋/eEst-6^F/S根据两对基因是自由组合的假设，可求得F₂的各种表型的分离比，按A组棋盘格法归纳可得：

［＋，F］∶［＋，F/S］∶［＋，s］∶［e，F］∶[e，F/S]∶[e，s]

此处［e，F］表示黑檀体，F带，余类推。

由此计算预期数与实得数比较求x²，以下表表示：

实验中，根据两对基因自由组合，求得F₂的6种表型的预期数，与实得数相比，两者相差较大。x²测验的P值小于0.01，表明Est-6基因与黑檀体基因不是自由组合的，而是在同一染色体上有连锁关系。

3.用最大似然法求Est-6～e重组值

已知Est-6与e是连锁的，现在进一步要估计这两基因的重组值。这要用到最大似然法（maximumlikelihoodmethod），其原理如下：

设P为重组值，m₁，m₂，…，Mt是分离出来各组的预期比例，a₁，a₂，…，a_t是相应各组的实得数。符号为m的预期值可用P来表示，这P值就是我们所要估计的。

得到我们实验中观察到的一套数值的可能性或似然性，可用多项式（m₁＋m₂＋…＋m_t）n的展开中的一项来表示，其中n是这套数据的合计。在这展开式中有关的一项是

最大似然法的目的就是要求出一个P来，把这个P代入公式中可以得到最大值。但要对这个公式进行微分是有困难的，幸而这公式本身和这公式的对数在同一P值有最大值，所以取这公式的对数，并对P进行微分。

似然性公式用L表示，则

对P进行微分，并使之等于0，则得估计方程式（equationofestimation）

这公式的答数之一就是我们要求的P值。不会有那个根都是我们需要的问题，因为所有其他答数都不可能作为重组值的。

现在回到我们具体的例子，杂交组合是

雌性双杂合体产生的配子有4种，两种是亲代原有的组合，或亲组合；两种是亲代没有的新配合，或重组合。雄蝇的连锁是完全的，所以双杂合体产生的配子只有两种，都是亲组合。设P为e～Est-6间的重组值，则可得出雌蝇四种配子的比例，并可求得F₂的表型比例。

把上表中的表型按类别归纳，各乘以总数n。得预期数，然后再写上各表型的实得数

有了实得值，又有了预期值，我们就可以代入上述似然性方程式，并略去第一项，因为这一项在微分时消失。

对上式微分，并使之等于0，则估计方程式成为

移项整理后，得

34P²-55P＋14=0

P=0.3165或31.65％。得出P的估计值后，我们还想知道它的标准误差（S_p）。Fisher已经证明

在我们现在这个例子中，计算是不难的。我们已经有了 ，我们只要再微分一次，然后用预期值代替观察值，那就是说用mn代替a，这样就得到

把P的估计值代入，得S²_p=0.009746，从而S_p=0.0987或9.87％。查果蝇基因图，得知基因e位于第三染色体。现在根据第二代的分离比，Est-6与e连锁，有31.65％重组值，所以Est-6也在第三染色体上，与e的图距为31.65。