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KO细胞的常见问题解答 

• 往期回顾

Q1: 基因敲除的sgRNA如何设计？

Q2: 如何避免脱靶效应？ 

• 本期内容

Q3：CRISPR-Cas9系统的活性检测方法有哪些?

通常我们都是采用各个设计网站预测，得到我们的gRNA，那如何能够快速、准确的验证CRISPR-Cas9系统是否能发挥作用呢？

• 荧光活性检测法。在Cas9和gRNA的作用下，靶点位置的双链DNA会被切割形成DSB，细胞通过同源重组形成有活性的荧光蛋白，可通过流式细胞仪来检测荧光强度是否增强，以此来判断Cas9及gRNA的活性及敲除效率。

• 错配酶法。对修饰后的靶序列进行PCR扩增过程中，会形成含有错配的DNA双链，将经过错配酶切割后的产物进行凝胶电泳，检测CRISPR-Cas9系统的切割活性。

• 套峰检测法。对修饰后的靶序列进行PCR并测序，通过分析Spacer区域套峰情况来分析CRISPR-Cas9系统的活性。 

Q4：实现基因功能缺失，我要做敲低（RNAi）还是敲除？

• 当敲除可能会导致细胞增殖非常缓慢或停止生长，或在细胞转染后的cell pool阶段检测效率呈显著下降趋势，即可判定可能出现敲除致死的情况，建议用RNAi。

• 由于存在部分强功能蛋白，即使表达下调了，仍然有较强的功能，如果RNAi始终做不出表型，但从有关信息推测这个基因很大可能性会出表型，建议做KO；另外，研究的目的基因处于非转录区域，或者目的基因有很强的转录效率，也是无法用RNAi进行有效干扰的，则建议做KO，且KO细胞更适合进行回补实验。

• 最后，敲低跟敲除不是二选一的关系。当我们用RNAi做了基因敲低，观察到细胞表型的变化后，仍然可以进一步做敲除，让实验结论更加有说服性。 

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