C57BL/6小鼠是使用最广泛的近交系小鼠，被应用于免疫学、神经生物学、肿瘤学等生命科学研究，同时也是基因工程小鼠的最主要背景品系。在免疫学研究中，从C57BL/6小鼠脾脏中获取免疫细胞是一种常规操作。

请想象以下场景：正在取小鼠脾脏的学生发现脾脏出现了黑色斑点（图1），“老师，大事不好，我们的小鼠怕是被感染了。你看，小鼠的脾脏坏死了，一端已经变黑了。”估计很多动物设施管理者都会被惊出一身冷汗。

笔者查阅了相关文献并做了初步实验，确定该现象是非白化小鼠自身的色素在脾脏沉积的自然现象且与毛发生长周期性有关，对基础免疫学实验没有影响。

PART 01

C57BL/6小鼠脾脏出现黑色斑点的现象，首次报道要追溯到1967年，Weissman等人在上免疫学实验课时发现C57BL/Ka和C57BL/6小鼠的一些脾脏上有黑色的斑点。C57BL/Ka×Balb/c F1代小鼠的脾脏上也发现了黑色斑点，但是Balb/c小鼠（白化小鼠）脾脏无黑色斑点。初步研究发现该现象没有明显的孟德尔遗传规律。随后的实验发现脾脏中的黑色斑点不能被普鲁氏蓝染色，排除了含铁的色素。

另外可以用DOPA氧化酶染色，可以被过氧化氢漂白，说明脾脏黑色斑点中含有真黑色素（melanin）^[1]。该现象加几个实验组成的文章发表在Nature（发顶刊这么容易吗？有没有被惊到）。文中Weissman等人讨论了这些黑色素细胞可能是从其它组织迁移而来。

PART 02

1977年，Auriol C等人在对C57BL/10接种支原体的实验中也发现了这种现象，并排除了支原体感染的影响^[2]。1989年，Veninga, T.S等人动用了电镜等多种观察手段，发现是脾脏红髓中的巨噬细胞吞噬了色素颗粒^[5]（图2）。

1995年，van der Heijden等人研究进一步认为脾脏黑色斑点主要是由真黑色素（melanin）造成的，脂褐质（lipofuscin）或血铁黄素（haemosiderin）不是造成该现象的主要色素。

至此，对小鼠脾脏黑色斑点的研究主要集中在切片镜检等光学形态学观察手段^[4]。

PART 03

更深入的研究出现在2005年，从事色素研究的Przemyslaw M. Plonka等人首次使用电子顺磁共振波谱（EPR）证明了C57BL/6脾脏黑斑含有真黑色素（melanin）。并且还发现脾脏黑斑现象与毛发周期之间的相关性（图3），他们发现在小鼠毛发周期的退化期，存在多达50-80%的黑色素沉着脾脏，而在处于毛发周期深层休止期的小鼠中，黑色素变性脾脏的百分比约为15%。EPR观察到的脾脏真黑色素与皮肤中发现的色素（毛囊黑色素细胞和发干）不同。与皮肤色素相比，其功率饱和度和线宽揭示了顺磁性中心的异质性，这表明色素存在部分降解^[6]。

PART 04

2009年Przemyslaw M. Plonka已经成为通讯作者，他们实验室延续了前面的研究，发现与年轻C57BL/6小鼠相比，老年C57BL/6小鼠没有表现出肉眼可见的脾脏黑斑。认为小鼠的脾脏黑色素沉着现象一定程度上与毛发周期同步的皮肤黑色素沉着有关，并且脾脏黑色素在小鼠一生中逐渐降解。因此小鼠脾脏黑色素沉着可能是一种研究体内衰老和黑色素降解机制的独特现象^[7]。

2015年Przemyslaw M. Plonka实验室继续发现脾脏黑色斑点也出现在129/SvJ野鼠色（agouti）小鼠上（图4）。由于野鼠色agouti（agouti）表型是小型野生哺乳动物（如啮齿动物）的基本表型，对它们来说是一种伪装色。这说明与毛发色素沉着相关的脾脏黑色斑点现象并不是一种仅在实验室近交系小鼠中观察到的奇异现象。这一现象也可能出现在野外动物上^[3]。

有关小鼠毛色更详尽深入的内容可参阅本公众号前文《小鼠的毛色是如何形成的？》及《小鼠毛色变化的分子成因》。

笔者实验室经常做小鼠胚胎移植实验，需要用到大量C57BL/6（黑色）小鼠和ICR（白化）小鼠。经过一段时间的观察，发现不同批次C57BL/6小鼠脾脏黑斑出现的平均概率在15%左右，无明显遗传规律。ICR小鼠脾脏无黑斑现象。

笔者通过HE染色切片，发现与正常脾脏相比，黑斑脾脏的红髓、白髓、生发中心等结构完整，数量正常，无炎症和坏死现象（图5）。黑斑脾脏中红髓部分散落着明显的黑色细胞。六胺银染色结果显示黑色斑块形状、大小完全不一致，可以排除微生物感染（图5），与Veninga, T.S等人的实验结果类似[5]。

笔者还检测了黑斑脾脏的C57BL/6小鼠的血常规数据，并使用流式细胞术检测CD4+和CD8+阳性T细胞的比例，发现与无黑斑脾脏小鼠相比无显著差别（结果不显示）。

小鼠脾脏黑色斑点这种现象貌似没有太大用处，目前可以确定小鼠基础生理指标和一些基础免疫学指标正常，对免疫学研究应没有影响。但是否可以作为人类色素沉着症的模型需要进一步研究考察。

参考文献：

[1] Weissman, I., Genetic and histochemical studies on mouse spleen black spots. Nature, 1967. 215(5098): p. 315.

[2] Auriol C, Hill,., H. Georgis, and J. Breaden, Pigment in the spleen of C57BL/10ScSn and related mice. Experientia, 1977. 33(7): p. 954-5.

[3] Michalczyk-Wetula, D., J. Wieczorek, and P.M. Plonka, Splenic melanosis in agouti and black mice. Acta Biochimica Polonica, 2015. 62(3): p. 457-463.

[4] van der Heijden, A., et al., Spleen pigmentation in young C57BL mice is caused by accumulation of melanin. Lab Anim, 1995. 29(4): p. 459-63.

[5] Veninga, T.S., R.A. Wieringa, and H. Morse, Pigmented spleens in C57BL mice. Lab Anim, 1989. 23(1): p. 16-20.

[6] Plonka, P.M., et al., Splenic eumelanin differs from hair eumelanin in C57BL/6 mice. Acta Biochimica Polonica, 2005. 52(2): p. 433-441.

[7] Michalczyk, D., et al., Extradermal melanin transfer? Lack of macroscopic spleen melanization in old C57BL/6 mice with de-synchronized hair cycle. Acta Biochimica Polonica, 2009. 56(2): p. 343-353.