孟飞龙/叶菱秀团队解开40年难题,揭示DNA柔性在抗体基因超突变中的作用
作为适应性免疫系统中的核心成员,抗体在对付病原体方面发挥着至关重要的作用。在抗体产生过程中,初级抗体库是通过V(D)J重排产生的,对抗原的亲和力相对较低。之后,由AID胞苷脱氨酶启动的体细胞超突变(SHM)会在抗体编码序列中引入突变,提升抗体对抗原的亲和力,从而实现抗体的亲和力成熟。
之前的研究发现,超突变在抗体可变区的外显子上并非均匀分布,而是集中在三个非连续的互补决定区(CDR)。早在20世纪80年代,科学家们便提出了超突变为什么具有偏好性的问题,但四十多年来,这仍然是一个谜。
中国科学院分子细胞科学卓越创新中心孟飞龙团队和上海交通大学医学院上海市免疫学研究所叶菱秀团队近日在《Cell》杂志上发表题为“Mesoscale DNA feature in antibody-coding sequence facilitates somatic hypermutation”的论文,揭示了CDR区域通过高度柔性的特征引发高频突变的分子机制。这项研究为优化抗体发现和设计新一代的人源化动物模型打下了基础。
研究材料与方法 在这项研究中,研究人员构建了携带IgVH-乱序等位基因的小鼠模型以及CDR3序列改变和FR3序列改变的小鼠模型(其中IgVH-FR3TAC乘客等位基因小鼠模型由赛业生物提供)。他们通过高通量测序开展了体细胞超突变分析,并在多种底物上开展脱氨分析。他们还通过分子动力学模拟和多种生化分析来研究AID与不同底物的相互作用。
技术路线 01建立体外检测抗体基因突变的新体系,发现AID酶活反应重现小鼠抗体基因突变模式 02通过抗体基因序列的随机置换,发现周围序列背景决定WRC基序的突变程度 03通过分子动力学模拟和多种生化分析,发现DNA柔性有助于CDR区域发生超突变 04柔性序列的引入可将突变“冷区”转变为突变“热区”
研究结果 1.AID活性和DNA序列本身决定了CDR超突变性 胞苷脱氨酶AID是一种仅含198个氨基酸的蛋白质。体外分析表明,AID作用于单链DNA底物,且偏好作用于WRC(W=A/T,R=A/G)基序。然而,脱氨酶基序并不能解释体细胞超突变的CDR偏好性,因为同样的WRC基序也存在于抗体可变区内的骨架区(FR),而且广泛分布在基因组中。这些结果提示一些中尺度(5-50 bp)水平的元件可以增强特定WRC基序上的超突变。 研究人员从经典的生化方法出发,联合高通量测序技术,建立了体外检测AID脱氨酶活性的新方法(图1)。他们使用了一段124-nt的单链DNA底物,覆盖小鼠VHB1-8外显子中的FR3-CDR3序列,这段序列在体内表现出WRC突变偏好。他们发现,体内CDR高突变特征可以在体外AID脱氨酶活分析中完全重现。 体外AID脱氨酶活分析重现了体细胞超突变图谱[1] 接下来,他们将生化分析的DNA底物扩展到27种有颌脊椎动物的1084条抗体基因序列。他们发现,在使用体细胞超突变作为抗体多样化策略的动物中,包括人、恒河猴、食蟹猴、小鼠、大鼠、狗、鸭嘴兽及羊驼等,CDR突变偏好高度保守。相比之下,一些采用基因转换机制的物种,如鸡、牛、羊和猪等,则并未表现出如此强烈的偏好。 2.周围序列背景决定了WRC基序的突变性 那么,这种突变偏好是否受DNA序列背景的影响?为了检验这一点,研究人员构建了一个携带IgVH-乱序等位基因的小鼠模型,其中每个CDR或FR的一个WRC(AGCT/AGCA)基序被保留在相同位置,而六个WRC基序周围的序列被随机置换。他们发现,在序列改变后突变频率发生了显著变化。这表明不同的DNA序列背景中可能存在中尺度的元件,增强或抑制WRC突变。 于是,他们利用CRISPR-Cas9技术构建了11种携带不同CDR3序列背景的小鼠模型。他们发现,其中6个模型的C/G核苷酸突变频率降低,而1个模型的突变频率升高。值得注意的是,序列改变越靠近WRC基序,则对该位点的突变频率影响越大。这些结果表明,周围序列背景决定了体内WRC基序的突变程度。 为了绘制AID和单链DNA底物的潜在相互作用,研究人员在poly(dT)或poly(dA)的背景下对AID和AGCT底物进行了分子动力学模拟。他们发现,在T底物中观察到的相互作用在A底物中大大减弱,表现出一种截然不同的结合模式(图2)。模拟出来的结合与AID在不同底物上的脱氨活性一致,因为在T底物上的活性高于A底物。因此,他们认为AID与ssDNA骨架的静电相互作用决定了脱氨的优先顺序,而ssDNA碱基序列可能会间接影响结合。 脱氨优先顺序与AID-ssDNA相互作用有关[1] 3.DNA柔性有助于CDR区域发生超突变 之后,他们探讨了相关的物理特征,包括poly(dT)和poly(dA)在DNA柔性上的差异,其中poly(dT)最柔韧,而poly(dA)最僵硬。通过一系列分析,他们发现AID脱氨酶基序相邻序列的柔性会影响AID脱氨酶的活性。中尺度DNA序列的柔性越大,越有利于结合AID表面的正电荷片区,进而有助于突变的发生。单链DNA的柔性与嘧啶-嘧啶(Py-Py)二核苷酸的含量呈正相关。 通过分析抗体基因序列特征,研究人员发现CDR中的序列特征可能在密码子或非编码DNA水平上经过了进化选择。他们发现CTA和ACT等基序(即TAC相关基序)在CDR中高度富集。他们将相关柔性序列插入抗体基因突变低频区FR3中,构建了序列改变的IgVH-FR3TAC乘客等位基因小鼠模型(该模型由赛业生物提供),发现柔性序列极大地提高了FR3区域的突变频率,可将突变“冷区”转变为突变“热区”。
研究结论 DNA柔性在抗体基因超突变中的作用[1] 总的来说,这项研究揭示了CDR区域发生高频突变的分子机制,其中高密度的WRC基序和中尺度的DNA柔性都有助于CDR区域发生超突变。研究结果表明了抗体编码序列在指导超突变中的非编码作用,为设计下一代抗体基因人源化动物模型奠定了基础。
原文检索: [1]Wang Y, Zhang S, Yang X, et al. Mesoscale DNA feature in antibody-coding sequence facilitates somatic hypermutation. Cell. 2023 May 11; 186(10): 2193-2207. e19. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.03.030
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