LDLR位点基因突变引发动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种慢性免疫代谢炎症性疾病，临床上被广泛称为“坏胆固醇”的低密度脂蛋白（LDL）升高在动脉粥样硬化发展中发挥了关键作用。而炎症反应、吸烟、高血压和糖尿病则极大增加了该疾病发生的风险。 

血浆中LDL的过量积累，激活了巨噬细胞参与，诱发血管内皮的慢性炎症过程，巨噬细胞摄取LDL后，最终形成了所谓的“泡沫细胞”，该类细胞在斑块内的聚集，不仅增加了动脉血管厚度与硬度，也引起血管内皮层功能障碍，促进了动脉粥样硬化发展。如此炎症环境也加剧了斑块的不稳定性，增加了斑块破裂的风险，最终诱发严重的心脑血管疾病，导致心肌梗死、缺血性中风，以及外周动脉等疾病。 

家族性高胆固醇血症（FH）被证实是低密度脂蛋白受体（LDLR）基因突变，导致LDLR缺乏，引起LDL升高等代谢异常的一种罕见遗传病。FH患者体内LDL的过量积累，造成血管壁粥样硬化性斑块形成，导致血管狭窄、阻塞，从而诱发患者心肌梗死等心脑血管疾病。 

通过发现临床FH患者LDLR基因点突变的新位点，我们客户周斌教授模拟人突变位点，借助CRISPR/Cas9技术，成功建立了Ldlr-E208X点突变小鼠模型，并证实该基因突变新位点，可引起小鼠包括总胆固醇、Ldl和甘油三酯等升高，以及主动脉弓斑块形成等动脉炎粥样硬化病变发生。且应用注射AAV9病毒肝特异性表达Ldlr的基因疗法，实现小鼠体内Ldlr功能部分修复作用。 

野生小鼠先天抵抗动脉粥样硬化形成

动脉粥样硬化相关小鼠模型的应用研究最早始于1960年代，通过给小鼠提供30%高脂肪、5%高胆固醇和2%胆酸饮食策略，成功诱导小鼠高胆固醇血症发生，并观察到不同血管部位脂肪条纹形成，也观察到急性高强度炎症反应的出现，但却无法模拟人动脉粥样硬化的那种慢性低强度的炎症环境现象。 

如果改用低毒性15%脂肪、1.25%胆固醇和0.5%胆酸饮食策略，在诱导3-9个月后，动脉粥样硬化病变形成在不同小鼠品系中出现的差异性较大，却以小鼠主动脉弓出现小范围的脂肪条纹和无纤维化斑块形成为特征。 

基于单独应用高脂肪饮食策略诱导存在的问题和相关病变出现差异等因素，使得只用饮食策略诱导野生小鼠发生动脉粥样硬化变得非常困难。 

需要提醒的是，由于小鼠本身的某些生理特征，决定了小鼠先天就对动脉粥样硬化不易感。比如，1. 小鼠胆固醇组成中是以高密度脂蛋白（HDL）为主，LDL含量较低，使其总胆固醇含量维持在较低水平。而人则正好相反。2. 小鼠缺乏胆固醇酯转移蛋白（CETP），人却有该蛋白，该蛋白是促进胆固醇酯由HDL向极低密度脂蛋白（VLDL）转运作用。3. 与人比较，小鼠肠道吸收胆固醇能力也较弱，导致小鼠内源性胆固醇合成增加。4. 小鼠能产生额外的α-和β-鼠胆酸，该鼠胆汁酸促进小鼠肠道排泄胆固醇；5. 小鼠APOE没有其它变体亚型，而人APOE存在不同变体亚型，比如APOE2、E3和E4。 

C57BL/6J小鼠是最常用的较易感动脉粥样硬化小鼠品系

不同近交系小鼠品系对动脉粥样硬化发生的易感性存在差异。实验比较的十种近交系小鼠结果表明，C57BL/6J为最为常用较易感的动脉粥样硬化品系小鼠。C57BL/6小鼠更容易诱发肥胖、糖尿病，以及炎症损伤现象。

有比较研究表明，C57BL/6小鼠有相对较低的HDL，而BALB/c和C3H小鼠的HDL则相对较高。在诱导T细胞因子方面，C57BL/6小鼠主要诱导Th1 T细胞因子，特别是高水平的IFN-γ。Th1 T细胞可促进动脉粥样硬化形成作用。而BALB/c小鼠诱导Th2 T细胞因子，产生较低水平的IFN-γ。 

西方饮食诱导促进动脉粥样硬化形成

为了加速动物粥样硬化形成，多数情况下，实验动物需要提供促动物粥样硬化饮食，即典型的高脂肪和高胆固醇饮食，通常称之为西方饮食。通常正常标准饮食（chow）含脂肪为4～6%，胆固醇为小于0.03%；而西方饮食则以模拟西方人每日饮食习惯为标准，即21%脂肪加上0.15%胆固醇的组合策略。 

该种西方饮食不仅有明显促进动脉粥样硬化形成的作用，也常常被应用于诱导肥胖和代谢综合症小鼠模型实验中。需要特别强调的是，短期提供高脂肪饮食，不仅可显著影响到小鼠的免疫系统，也会影响肠道微生物。另外，还需要提醒的是，由于各种不同配方的西方饮食在不同实验中应用中，因其关键成分来源差异，可能会影响到研究结果的重复性与可比性。 

所以，是否应用西方饮食策略不是一个轻松简单的选择。一方面，该种饮食方式更接近该疾病患者的饮食生活习惯。另一方面，此种西方饮食也可能影响到某些细胞的一系列连锁反应，从而增加了研究鉴别各种影响作用特征的复杂性与难度。尽管如此，在建立实验标准化与缩短动脉粥样硬化进程方面，应用西方饮食仍是非常有用的诱导策略。 

Apoe敲除与Ldlr敲除小鼠为最常用动脉粥样硬化小鼠模型

小鼠成为研究动脉粥样硬化的主要动物模型是从1990年代开始，目前最为常用的动脉粥样硬化小鼠模型为Apoe敲除（约占研究70%）和Ldlr敲除（约占27%）。 

APOE为许多脂蛋白颗粒的结构糖蛋白，主要作为受体介导摄取的配体，在乳糜微粒和VLDL残留清除方面发挥重要作用。虽然主要在肝和大脑合成，也可由单核细胞和巨噬细胞产生。 

Apoe敲除小鼠于1992年成功构建，表现为血浆总胆固醇增高（主要为乳糜颗粒/VLDL）。用常规标准chow饮食，小鼠可出现复杂的动脉粥样硬化病变，包括严重高胆固醇血症与免疫调节功能的损害。血管病变主要位于主动脉弓和沿主动脉的不同分支点。如果用西方饮食策略，小鼠血浆总胆固醇水平，会比用常规普通Chow饮食，增加高出3倍以上。 

Apoe敲除小鼠模型优势为不需要西方饮食诱导，即可诱发小鼠出现明显动脉粥样硬化病变。然而，该模型特点是以VLDL作为血浆脂代谢主要成分，与人以LDL为主的脂代谢异常特征有一定差异。另外，APOE本身除了发挥介导脂蛋白清除作用外，也具有其它功能，比如抗氧化、抗增殖、抗炎症等作用。因此，Apoe敲除小鼠引起的动脉粥样硬化病变，可能不仅仅是依赖于血浆脂质水平的改变。 

Ldlr敲除小鼠模型成功构建，在一定程度上，克服了Apoe敲除小鼠的不足之处。比如，与Apoe比较，Ldlr的功能作用相对单一。缺乏ldlr引起的动脉粥样硬化，则更多与LDL脂蛋白稳态的改变密切相关。LDLR作为细胞表面受体，结合apoB100蛋白，参与介导LDL胆固醇的内吞作用，达到清除LDL目的。与APOE比较，人群中LDLR缺失更为常见，该基因突变是引起家族性高胆固醇血症的致病原因。 

Ldlr敲除小鼠于1993年构建成功，表现为血浆LDL胆固醇水平适度增加。用标准chow饮食时，小鼠要到12-15月龄时，才会出现明显的动脉粥样硬化病变。而用西方饮食诱导时，小鼠高胆固醇血症明显，且可出现大的动脉粥样硬化斑块。通常情况下，脂代谢与免疫系统损害不太明显。因此，Ldlr敲除小鼠常采用高脂饮食诱导策略，以加速斑块形成。 

Ldlr敲除小鼠模型模拟了人家族性高胆固醇血症临床特征，包括主动脉瓣和主动脉根部损伤。另外，该模型也有助于探讨动脉粥样硬化与糖尿病之间的相互关系。有研究表明，与Apoe敲除小鼠比较，Ldlr敲除小鼠更易发生肥胖和胰岛素耐受现象。 

Ldlr敲除小鼠模型也不是完美的。由于需要用西方饮食以加速动脉粥样硬化形成，而高胆固醇饮食诱导策略增加了实验结果的可变性，使得不同实验室结果进行标准化比较的难度也大大增加了。 

Apoe敲除与Ldlr敲除小鼠模型比较

前面说过APOE基因的多功能特征，比如不仅具有脂蛋白转移功能，也在其他方面（如血脑屏障的形成、血管功能、以及重要的免疫调节等）都发挥了一定作用。缺乏AOPE可能导致胆固醇转移紊乱，细胞增殖增加，以及全身性白细胞增多等。 

与Ldlr敲除小鼠比较，Apoe敲除小鼠因呈现更高的炎症反应水平，故也展现更多且明显的表型。Ldlr敲除小鼠中则呈现较弱脂代谢异常和免疫系统方面表型，这也许可被认为是该模型的某种优势。但是，Ldlr敲除小鼠更不容易发生损伤诱导的新生内膜形成。所以，Apoe敲除小鼠在研究血管成形术后潜在的再狭窄分子机制方面，仍然是一个更好的模型选择。 

用标准chow饮食时，Apoe敲除小鼠比Ldlr敲除小鼠更快出现明显表型。因此，Apoe敲除小鼠模型实际应用中，不需要考虑不同饮食喂养干预的复合影响因素。但我们也需要清醒认识到，Apoe敲除小鼠不需要高脂饮食来诱发动脉粥样硬化斑块形成，但人的动脉粥样硬化发展却是与西方饮食习惯密切相关。单基因突变的家族性高胆固醇血症与LDLR基因突变相关性在人群中为1/200比例，虽然APOE突变也存在于一定人群中，比例却相对较低。但两种小鼠模型都被认为与人疾病密切相关。 

考虑到高脂肪高碳水化物（富含葡萄糖或蔗糖）饮食方式，也是诱导C57BL/6小鼠肥胖和II型糖尿病（T2D）小鼠模型常用方法。研究表明，在该类饮食诱导策略下，Ldlr敲除小鼠较Apoe敲除和野生型小鼠更易发生T2D。所以，该两种敲除小鼠模型有助于揭示与动脉粥样硬化相关的代谢合并症。然而，不同实验室间在诱导特定疾病模型的实际研究中，由于饮食组成及诱导策略的易变性，使得相关实验结果的可比性与可重复性成为一种挑战。 

虽然两种敲除小鼠都对链脲霉素（STZ）诱导糖尿病表型发生敏感，有报道表明，经STZ处理的Apoe敲除小鼠，与STZ处理的Ldlr敲除小鼠比较，有明显促进动脉粥样硬化发生作用。提示APOE具有抵消糖尿病介导的危险作用。另外，研究也表明，这两种敲除小鼠除了有脂蛋白转移功能方面的缺陷外，也都表现一些其它代谢性和行为学方面的异常。 

Apoe敲除和Ldlr敲除小鼠与其他小鼠模型的联合应用

这两种敲除小鼠都有与其他相关小鼠交配，以研究代谢相关疾病的报道。比如，与Akita小鼠模型交配，因该小鼠存在胰岛素编码基因Ins2突变，导致胰岛素蛋白折叠错误，引起beta细胞程序性死亡增加。与Akita小鼠交配后，这两种敲除小鼠表现更加显著血管炎症和动脉粥样硬化表型，特别是雄性小鼠。这可能与雄性Akita小鼠的遗传背景影响其血压及其肾脏损伤有关。 

这两种敲除小鼠分别与相关肥胖小鼠交配，比如ob/ob和db/db小鼠，以探讨实验性动脉粥样硬化发展过程中，代谢综合症相关因素的影响。结果发现，Apoe和Ldlr敲除小鼠均出现肥胖、高脂血症和T2D，即使用标准chow饮食，随后也观察到高胆固醇血症及动脉粥样硬化病变加速形成。 

ApoE*3‑Leiden转基因小鼠和SRB‑1/Apoe双基因敲除小鼠也应用许多研究。用西方饮食诱导，ApoE*3‑Leiden小鼠模型可出现严重高胆固醇血症。如果与人CETP转基因小鼠交配，表现更接近人脂蛋白胆固醇分布情况。Apoe^-/-; Fbn1C1039G^+/‑双基因敲除小鼠模型则表现为易损的动脉粥样硬化斑块形成，导致斑块更易破裂发生。该模型为研究人不稳定性斑块特征提供了工具。 

考虑到血脂异常合并症，此两种敲除小鼠模型也被应用于研究非酒精性脂肪性肝炎诱发易感性。非酒精性脂肪性肝炎是一种表现为肝脂肪变性、炎症、肝损伤和肝纤维化等特征的疾病过程。相对于Apoe敲除小鼠，Ldlr敲除小鼠具有增加肝脏炎症反应、程序性死亡和肝纤维化等发生的作用。 

诱导高脂血症小鼠模型的新策略

PCSK9基因功能获得性突变（gain of function）特征在人群中的发现，不仅有益于开发治疗心血管疾病的新方法（比如PCSK9抑制剂），也为建立高胆固醇血症小鼠模型提供了新策略。PCSK9基因在肝脏高表达，存在于血循环中，与LDLR结合后，促进LDLR的降解，从而介导高胆固醇血症。而PCSK9功能性缺失突变体D374Y（DY）则具有抑制其正常功能的作用。因此，通过表达人PCSK9-DY突变体来建立动脉粥样硬化小鼠模型的优势在于，无需进行小鼠生殖细胞相关编辑，因而降低了小鼠模型构建的技术门槛与成本。 

借助腺相关病毒（AAV）尾静脉注射方法，建立长期肝表达人PCSK9-DY突变体小鼠模型表明，用标准chow饮食，小鼠胆固醇水平适度增加。而用西方饮食诱导策略，PCSK9 DY-AAV小鼠加剧的高脂血症与明显血管病变形成。除了观察到有巨噬细胞侵润和纤维化组织形成外，还伴有泡沫细胞和平滑肌细胞的存在，小鼠主动脉根病变以晚期斑块形成为特征。 

我们客户梁思佳教授应用AAV8表达人PCSK9-DY突变体，经尾静脉注射至NFATc3巨噬细胞特异性敲除小鼠的研究证实，NFATc3基因在巨噬细胞中的缺失，加速了PCSK9-DY诱导动脉粥样硬化病变的形成与发展。 

动脉粥样硬化小鼠模型的局限性及其影响因素

应用小鼠模型建立动脉粥样硬化形成的局限性，除了前面描述的小鼠先天抵抗动脉粥样硬化发生的某些特征外，也表现在下面几个方面，1. 小鼠冠状动脉太小，不易观察到，收集血液也比较困难。2. 考虑到小鼠与人在心血管系统解剖方面的不同差异，小鼠动脉内膜组成只含有内弹性层上的内皮细胞，且血管中膜也更薄且无血管滋养管；而人则含有平滑肌细胞或结缔组织和血管滋养管等。3. 小鼠模型观察的动脉粥样硬化病变形态学不同于人，比如小鼠无厚纤维帽形态出现。4. 小鼠动脉粥样硬化病变部位为主动脉和颈动脉，而人则发生在冠状动脉。5. 小鼠模型很少见非稳定斑块现象，即很少发生斑块病变破裂，而这是导致人急性梗塞发生，诱发心血管疾病死亡的主要直接原因。 

关于小鼠斑块病变很少破裂发生的现象，有研究者认为，在多数小鼠模型研究的有限观察范围时期内，要想发现动脉粥样硬化血栓形成的情况是很难的。有最新研究表明，如果对高胆固醇血症小鼠模型进行较长时间的实验观察，可在小鼠冠状动脉观察到动脉粥样硬化血栓形成的迹象。所以，那种认为动脉粥样硬化小鼠模型不能表现斑块破裂、心肌梗死和缺血性中风等表型是某种误解。然而，需要承认的是，在模拟人斑块病变破裂方面，动脉粥样硬化小鼠模型中斑块病变部位的不同分布与生物力学等特性方面，并非为最优模型选择。 

另外，我们也需要明白的是，动脉粥样硬化小鼠模型应用研究的结果，也会受到如下许多因素的影响。1. 小鼠遗传背景，比如C57BL/6J表型较Balb/c、129/J和FVB等都更加明显。2. 研究关注点差异，小鼠模型多数研究只关注病变损伤区域大小，而忽略其他相关因素，比如单核白细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞、钙化沉积物、胶原蛋白和坏死细胞碎片等。3. 性别因素，通常见雌性小鼠病变严重，而人则是男性患者更严重；4. 研究策略，多为基因全身敲除或高脂饮食诱导，导致从多基因与信号通路收到影响，可能引起旁路方式而非直接作用效果；5. 其它可变因素，不同小鼠模型、研究方法与技术、饲料/饮食组成、研究时间长短、鼠龄、饲养环境，以及小鼠研究数量等。 

小鼠模型相关参考资料：