研究人员首先分析了MTHFD2的表达和功能是否与巨噬细胞极化有关。在M1和M2极化模型中，MTHFD2的表达均升高，表明它可能是巨噬细胞极化的重要调节因子。利用siRNA抑制小鼠巨噬细胞系RAW264.7中的MTHFD2后，M1型标志物Nos2和Il-6表达显著上调，而M2型标志物Arg1和Retnla表达显著下调。 

研究人员将赛业生物提供的Mthfd2^fl/fl小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交，培育出髓系细胞特异性MTHFD2敲除小鼠（MTHFD2-KO-Mφ小鼠）。他们发现，与WT小鼠（MTHFD2-WT-Mφ小鼠）相比，KO小鼠（MTHFD2-KO-Mφ小鼠）BMDMs中的M1型标志物上调，而M2型标志物被抑制。MTHFD2过表达则抑制M1型标志物，但增强M2型标志物表达。这些结果表明，MTHFD2可以调节巨噬细胞的极化。 

为了进一步研究髓系MTHFD2是否调节体内巨噬细胞的极化，研究人员在MTHFD2-KO-Mφ和MTHFD2-WT-Mφ小鼠上建立了肿瘤移植模型。与WT小鼠相比，KO小鼠的肿瘤生长较慢，肿瘤切片中的F4/80⁺巨噬细胞数量增加了近2倍（图1）。表达iNOS的细胞数量明显增加，而表达ARG1的细胞数量减少，这表明Mthfd2缺失会促进M1型巨噬细胞极化，并抑制M2型巨噬细胞极化。 

由于表达ARG1的巨噬细胞在促进纤维化缓解方面发挥重要作用，故研究人员利用CCl₄诱导的肝纤维化模型来分析MTHFD2在调节M2表型上的作用。MTHFD2缺失导致ARG1阳性的巨噬细胞显著减少，表明MTHFD2对M2表型有正向调节作用。此外，通过甲壳素模型的分析，他们发现髓系MTHFD2缺失会减少嗜酸性粒细胞的招募并降低ARG1的表达，进一步提示了MTHFD2在促进M2型巨噬细胞功能上发挥重要作用。

图1 MTHFD2在体内调节肿瘤相关巨噬细胞的极化^[1] 

之前的研究发现，Akt-mTORC1信号传导对IL-4诱导的M2型极化至关重要。有意思的是，在MTHFD2-KO BMDM中，Akt^S473和Akt^T308的基础磷酸化及IL-4诱导的磷酸化都明显减弱。那么，Akt激活的减少是否与M2型极化缺陷有关？研究人员用Akt激活剂SC79处理MTHFD2-KO BMDM后，发现巨噬细胞极化的缺陷得以挽救，表明Akt信号转导对MTHFD2缺失诱导的异常极化很关键。 

蛋白激酶PI3K和PTEN可通过平衡PIP3的浓度来调节Akt的激活。他们发现，在经过IL-4和IFN-γ处理的MTHFD2-KO和WT细胞中，PI3K的表达和活性相当，PTEN表达也相当。然而在基础条件和IL-4处理条件下，MTHFD2-KO细胞中PTEN的PIP3磷酸酶活性均高于WT细胞。与此相一致的是，PTEN的敲除可明显挽救MTHFD2-KO细胞中的Akt磷酸化。综上，这些结果表明，MTHFD2抑制了PTEN的PIP3磷酸酶活性，从而促进了Akt的激活。 

通过共聚焦免疫荧光显微镜观察和免疫沉淀分析，研究人员发现MTHFD2能够与PTEN发生相互作用。通过构建MTHFD2的N端缺失突变体（缺少线粒体靶向信号），他们发现MTHFD2与PTEN的结合以及PTEN的PIP3磷酸酶活性和Akt信号转导均不受影响。此外，IL-4刺激明显增强了这种相互作用，而IFN-γ处理则没有。由此可见，线粒体定位并不是MTHFD2与PTEN结合的必要条件，且IL-4处理促进了这种相互作用。 

通过ClusPro蛋白对接分析，他们进一步发现MTHFD2的氨基酸残基（aa 215-225）可直接靶向PTEN的催化中心（aa 118-141）（图2）。链霉亲和素pull-down和SPR分析发现，合成的PTEN（aa 118-141）生物素肽段能够与胞内或重组MTHFD2蛋白相互作用。同样地，MTHFD2（aa 215-225）生物素肽段也能与胞内或重组PTEN蛋白相互作用。与WT MTHFD2相比，缺乏aa 215-225的MTHFD2能够显著减少PTEN的PIP3磷酸酶活性降低。这些结果表明，MTHFD2直接靶向PTEN催化中心以降低PTEN的PIP3磷酸酶活性。 

MTHFD2直接靶向PTEN催化中心并抑制PTEN的PIP3磷酸酶活性^[1] 

MTHFD2需要无机磷酸盐和镁离子来支持其依赖于NAD的脱氢酶活性，而以往的研究发现MTHFD2 D168是镁离子结合位点，而R201是无机磷酸盐与NAD结合的主要位点。因此，研究人员通过突变分析来确定这些结合位点对MTHFD2与PTEN相互作用的重要性。他们发现，D168E突变体与PTEN的结合明显减少。在MTHFD2-KO BMDM中，过表达MTHFD2可使M1型和M2型标志物恢复到WT细胞的水平，但过表达D168E突变体只能部分恢复表型。从这些结果可以看出，MTHFD2 D168对于MTHFD2与PTEN的结合并抑制PTEN的PIP3磷酸酶活性很关键。 

图3 MTHFD2调节巨噬细胞极化的机理示意图^[1] 

总的来说，这项研究通过体外和体内研究揭示了MTHFD2的一个重要非代谢功能：它通过与PTEN的催化中心相互作用来调节PTEN活性，从而重编程巨噬细胞极化并改变巨噬细胞介导的免疫反应（图3）。它表明调控MTHFD2可作为一种策略来调节巨噬细胞介导的免疫反应。