啮齿类实验动物是使用最多的实验动物，其微生物质量控制一直是实验动物设施管理者的工作重点。每个设施都有自己的动物健康监测方案，其中哨兵鼠（Soiled Bedding Sentinels, SBS）长期以来应用最为广泛。但由于哨兵鼠方案本身存在的一些缺点，常常无法及时有效地监测微生物污染的发生，且需要额外使用动物，并不符合3R原则（详见本号前期文章：哨兵鼠设置，你想知道的都在）。

近几年，国际上有越来越多的设施将环境样本PCR检测（Environmental Health Monitoring, EHM）作为哨兵鼠方案的补充或替代方案，以便更及时灵敏地监测动物（条件）致病微生物感染和携带状况。我国也有少数设施采取这种监测方案。该方案不仅提高了检测的敏感性，还减少了动物使用数量，同时在哨兵鼠设置和饲养上的时间和金钱成本也得到了节省。随着该方法的不断优化和普及，哨兵鼠方案在欧美多国有逐渐被取代的趋势。本文就简要介绍一下EHM方案。

1 EHM方案的采样方式

EHM方案最早采用无菌拭子擦拭附着在出风口的粉尘（Exhaust Air Dust，EAD），或用特定大小的纱布或滤纸固定在出风口初效过滤器上收集粉尘。后来泰尼百斯、Allentown等笼具公司设计了专门的采样口/卡槽并配套使用采样卡，使得样本采集更加简便，并标准化。这两种方法都需要废气排出时不能在笼盒水平进行空气过滤。目前在美国、加拿大等国家这两种方法都是被普遍使用的采样方式。

近几年，将植绒拭子、滤纸等介质放入脏垫料盒中代替哨兵鼠，通过充分接触可能存在的病原微生物进行采样的方法也被逐步采用。该方法不仅适用于所有设计形式的笼具，同时还可有效避免由于笼架清洗不充分所残留的核酸引起的假阳性结果。

不论是使用哪种采样方式，获取的样本都是用PCR方法检测目标病原体核酸，而由于PCR方法的高敏感性，因此足以检测到样本中的微量核酸。

Jensen, JAALAS, 2013

Miller, JAALAS, 2016

Mahabir, Lab Anim., 2018

Pettan-Brewer，JAALAS, 2020

Varela，JAALAS, 2022

2 检测结果的准确性

在综合分析了已公开发表的33篇文献后发现，脏垫料哨兵鼠方案对各种病原体的总检出率约76%，而EHM的检出率约96%。（详见表1）

目前小鼠肝炎病毒、小鼠细小病毒、仙台病毒、嗜肺巴斯德杆菌、螺杆菌、鞭毛虫、蛲虫及螨虫等多种病原体都已证实可在EAD样本中准确检出。特别是其中有些病原体在脏垫料哨兵鼠方案会漏检，但却可以成功通过EHM检测到，例如仙台病毒、嗜肺巴斯德杆菌、螺杆菌、鼠阿米巴、蛲虫等。但是也有一些病原体，尚未证实可以检出，或不同研究显示其检测效果尚有争议，例如轮状病毒、链球菌等。

表1：不同病原体在脏垫料哨兵鼠和环境样本中的检出情况

*：检出某病原体的文章数量/评估某病原体的文章数量

3 欧美实验动物设施EHM使用情况

一项覆盖美国、加拿大、欧洲、英国等多个国家和地区的111个动物设施的调查报告显示，在大小鼠的月度和季度常规健康监测中，有11%的设施单独使用EHM，41%的设施单独使用脏垫料哨兵鼠，46%的设施使用多种方案组合，此外有2%的设施不进行常规健康监测。

对于检疫期啮齿类动物，由于有更高的时效性要求，有更多人会选择EHM方案，在被调查的111个设施中，63%的机构单独使用EHM，15%的设施单独使用脏垫料哨兵鼠方案，14%的设施使用多种方法组合，还有8%的设施不检测检疫期动物。

由以上数据可以看出，目前在检疫检测中，由于EHM可以更快反馈结果，因而使用更广泛，但在常规健康监测中用EHM将脏垫料哨兵鼠完全替代的还是少数。但业内人士普遍相信，随着越来越多的数据支持、广泛的宣传和专业指导，使用EHM方案的设施数量会越来越多。

4 实施EHM监测前应该评估的内容

笼架和笼盒构造可能是在实施EHM方案前最需要考虑的因素。如何采样、采样位置选择将直接影响监测效果，因此建议对于不同类型、不同厂家的笼具都应该充分验证采样时间、方式和位置后再正式使用。

如果设施中曾经发生过某种微生物污染，或所使用的垫饲料中残留某种微生物的核酸，那笼架出风口粉尘样本中就很可能存在其核酸片段，这就会造成假阳性结果。例如，某设施在做验证时发现在用出风口粉尘样本检测时可以检测到大量绿脓杆菌核酸，但最终证实动物并没有感染，环境中也没有活菌，而是所使用的饲料中存在绿脓杆菌核酸，这种混淆会耗费大量精力和成本。

对于多数设施来说，使用哨兵鼠方案则可以通过购买商业化试剂进行自检，但如果使用EHM方案，则需要进行PCR自检，那很可能由于方法验证不充分、实验室条件不适宜、气溶胶污染等多种因素造成实验结果的不可靠。如果将EHM样本送检专业第三方检测机构，检测成本则要明显高于哨兵鼠检测。尽管在哨兵鼠购买、饲养、样本采集等方面需要消耗更多资金和劳动力成本，甚至经过折算这部分成本是高于支出的检测费的，但相较于检测费，这些成本更为“隐形”。

由于标准更新的周期漫长，目前国标GB/T 14926中检测病原微生物的主要方法是血清学方法、培养法和镜检法，而极少提及分子生物学方法，这也使得不同实验室间方法不统一，使得其推广应用及不同机构间互认的阻碍增加。

5 展望

总而言之，目前在美国、加拿大、欧洲等国家和地区，EHM的验证和应用越来越广泛，已经有少数设施完全取消了脏垫料哨兵鼠的使用，每年可减少数万只哨兵动物的使用。我国开展验证和应用EHM方案的机构数量还十分稀少，但是也逐渐有越来越多的设施管理者开始关注并尝试。所以短期内脏垫料哨兵鼠还是会被广泛应用，但是随着管理人员对结果时效性、敏感性的要求的提高和方法的充分验证，EHM一定会被更多使用，并逐步替代哨兵鼠方案。

参考文献：

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2. https://na3rc.sharepoint.com

3. Winn CB, Rogers RN, Keenan RA, Gerwin PM, Matthews KA, Ramirez JA, Bennett TE, Perkins CL, Henderson KS. Using Filter Media and Soiled Bedding in Disposable Individually Ventilated Cages as a Refinement to Specific Pathogen-free Mouse Health Monitoring Programs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2022 Jul 1;61(4):361-369. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-22-000013. Epub 2022 Jun 24. PMID: 35750479; PMCID: PMC9674011.

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