实验方法
实验动物危害的监督与管理
目前的科学发展水平尚不能完全脱离实验动物进行生命科学研究，尤其是涉及生物安全方面的实验研究。在动物实验中，对实验室的不科学管理可导致病原微生物的传播，污染室内环境，如果实验室人员防护或操作不当，就会接触到污染物而被感染。实验动物研究机构要不断完善检疫制度，制订详细的管理措施，将实验和特殊微生物操作、安全性设备及单位规定的生物安全制度相结合。
一、实验动物的环保管理
1.废气的环保管理
(1)动物室设置独立的空调系统或除臭设备，利用气压差控制废气排放。
(2)对啮齿类动物，需要降低饲养密度，增加换气次数，使用具有辅助换气功能的隔离饲养盒(如IVC等)。
(3)对大中型动物，需要增加清洗排泄物次数。
2.污水的环保管理
(1)一般清洗动物设施的污水可排入一般废水处理系统。
(2)感染性微生物动物实验所产生的污水，可能威胁人体健康及环境卫生，需经化学处理(例如次氯酸钠)或加热高压蒸气灭菌，才能排放。
3.垫料的环保管理
(1)一般废弃垫料，多以掩埋方式处理，也可焚烧。
(2)感染性物质污染垫料，经灭菌后再以焚烧或掩埋方式处理。事先需以印有“生物危害标志”的塑料袋密封，贮存于特定场所，当日高压灭菌后送出。
(3)具放射性物质垫料，以印有“放射性物质标志”的塑胶袋包装，贮存于特定容器与场所，再由专门人员收集处理。
4.动物尸体环保管理
(1)使用专门盛放容器，冷藏防止腐败。
(2)无毒害的动物尸体，可直接按生物垃圾处理或焚化。
(3)感染性动物尸体，经密封包装后，高温高压灭菌，再贮存或焚化，冷冻尸体要解冻后再焚化。
(4)具有放射性物质的动物尸体，经特殊包装后，以烘箱60～70℃将尸体烘干，再按照废弃放射性材料处理。
(5)动物解剖室需设置负压解剖台，排气需经过滤处理以去除微生物等。
5.病原微生物环保管理
(1)隔离动物房排放的空气，需经过空气过滤装置。
(2)避免人为因素造成病原微生物外流。
6.工作人员健康评估
(1)工作人员定期注射破伤风等疫苗。
(2)动物来源要明确，提供商要提供检疫状况。
(3)注意防止病原微生物感染。
(4)不同实验动物可以产生不同的人畜共患病。
(5)血清操作应在BSL-2或BSL-2以上实验室进行。
7.放射性物质安全管理 动物实验中因为使用仪器所产生α、β、γ、中子或X线等放射线照射动物，可使实验人员及动物饲养管理技术员，可能暴露于上述放射线。另外，放射性同位素动物实验也是放射线来源之一。这些放射性仪器及放射性物质的使用，须依有关规定、使用办法及规范来执行。使用隔绝板以减少放射线物质暴露、监测工作人员暴露剂量。正确处置放射线废弃物，对工作人员进行安全培训。
8.动物房内致敏原 动物房内有很多致敏原，如动物皮屑、毛发、有过敏体质的人不适合在动物房内工作。动物的皮屑又叫表皮致敏原，吸入后能引起I型变态反应，动物房管理员或动物实验者还应注意对小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猫和猴等动物过敏。
二、常见人畜共患病病原及防护
1.汉坦病毒(hantavirus) 经呼吸道吸入啮齿类动物的分泌物(如尿粪等含汉坦病毒的体液)飞沫而感染。临床以发热、出血和肾损害为主要临床表现的人畜共患病。野外主要感染黑线姬鼠和褐家鼠，实验动物主要感染大鼠。大鼠感染后无症状，不死亡，但多数动物可发生毒血症。可终生排毒，污染环境，从而危及动物饲养管理和动物实验人员的健康。要采取有效的灭鼠措施，加强饲养管理和定期检测，一旦发现问题立即采取措施。脂质溶剂如酒精及一般的清洁剂或漂白水便可将汉坦病毒消灭。避免汉坦病毒传播的最重要方法便是小心的以清洁剂或漂白水将已死的小鼠或小鼠存在的区域擦拭。操作可疑血清时需在BSL-2或以上安全等级实验室进行。1994年4月的统计报告指出有17个国家发生68例，病死率达60％。日本有100多人被实验室大鼠传染汉坦病毒。
2.淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV) 野生小鼠、实验鼠、豚鼠为重要感染源。病毒有可能出现在血液，脑脊髓液，尿液，鼻咽分泌物，粪便和被感染的天然宿主及人体标本中。人类在1～3周的潜伏期后会有类似流行性感冒一样的症状，如发热、肌肉疼痛、头痛和身体不适。实验动物一般需进行以下措施防范：新进动物隔离及定期检疫；免疫荧光法与ELISA为最常用的检测方式；检测前加热可疑血清样品56℃ 30min可有效灭活病毒；若发生动物群体感染，需清除整个群体；LCMV可以经胎盘感染，所以不可使用剖宫净化术。
3.弓形虫 弓形虫病是由弓形虫引起的，能够在人与动物之间传播的人畜共患病。小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、犬和猴为中间宿主，猫为终末宿主。自然感染的大鼠、小鼠和地鼠基本不呈现临床症状。但组织切片上可见灶性脑炎。豚鼠主要表现肝、脾大，幼龄鼠可出现角弓反张，排粪、排尿紊乱。猫急性发病时出现体温升高、嗜睡、呼吸困难，有时出现呕吐和腹泻。犬发病症状类似猫，有时还出现运动失调。猴出现脑炎时表现转圈、抱头，共济失调以及惊厥。预防要加强饲养管理，防止猫类对饲料、饮水的污染。淘汰动物应进行焚烧处理，严防被猫吞食。
4.沙门菌 对实验动物威胁较大的是鼠伤寒和大肠杆菌。在动物中可交叉感染，或同时感染两种沙门菌。实验动物的沙门菌病主要发生于小鼠和豚鼠，是由鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌引起的以肠炎、败血症为特征的一种传染病，该菌经消化道或结膜感染。幼龄动物较成年动物更为敏感。野鼠是本病的主要传染源。加强饲养管理，防止野鼠进入动物室。对发病动物应立即淘汰，以免引起人员感染。
5.狂犬病毒 狂犬病又称恐水症，是由狂犬病病毒感染引起的以极度兴奋、狂躁不安、流涎、攻击人兽为特征的一种高度接触性人畜共患病。病毒通过患病犬或带毒犬的咬伤而传给正常动物或人，也可通过消化道和呼吸道及损伤皮肤、黏膜感染。对实验犬要定期接种疫苗。人被犬或其他动物咬伤后也应立即接种疫苗。发现病犬应立即处死，并向有关防疫部门报告。
6.布鲁轩菌 布鲁杆菌病是由布鲁杆菌感染引起的一种以生殖系统侵害为特征的人畜共患病。主要表现为睾丸炎、附睾炎、淋巴结炎、关节炎、流产和不育等特征。
7.钩端螺旋体 钩端螺旋体病是由钩端螺旋体感染引起的一种重要而复杂的人畜共患病和自然疫源性传染病。在世界各地流行，热带、亚热带地区多发，我国南方部分地区较为严重。一般常用消毒剂的常用浓度均易将其消灭。钩端螺旋体的动物宿主非常广泛，几乎所有温血动物都可感染，其中啮齿类是最重要的贮存宿主。鼠类带菌时间长达1～2年，甚至终生。主要通过皮肤、黏膜和消化道感染，也可通过交配、人工授精和在菌血症期间通过吸血昆虫如蜱、蛇、蝇等传播。预防主要是对动物房舍进行经常性消毒，防止饮水、饲料污染，动物运输时减少损伤。
8.志贺菌 志贺菌病是由志贺菌引起人和实验动物肠道感染的一种疾病。人和猴以细菌性痢疾为主要症状。该细菌有A、B、C、D四个群45个血清型，对人和实验动物均有致病性，主要在人类和灵长类动物间传播，苍蝇和蟑螂是重要的传染媒介。
9.猴B病毒 B病毒又称疱疹病毒，猴是B病毒的自然宿主，感染率可达10％～60％。多数情况下呈良性经过，仅在口腔黏膜出现疱疹和溃疡，之后病毒可长期潜伏在呼吸道和(或)泌尿生殖器官附近的神经节。人类感染主要表现脑脊髓炎症状，多数患者发生死亡。饲养猴类要以自繁为主，定期检疫，淘汰抗体阳性猴，建立无B病毒猴群。对野外捕获的猴，应严格隔离检疫，确认无B病毒后方可用于实验。
10.结核杆菌 结核病是由分枝杆菌属结核杆菌引起的，以动物多种组织器官中形成结节性肉芽肿和干酪样坏死为特征的一种人畜共患病。结核患者和患病动物是本病的传染源，尤其是开放性结核患者。主要通过空气传播，也可通过患病动物排出的粪尿等排泄物污染饲料和饮水而感染其他动物。对引进的动物实行严格的检疫，防止结核杆菌传入猴群。对确诊结核病的猴应立即处死，并对饲养环境以及用具进行彻底消毒，以防感染其他动物和人。
三、物理性、化学性、实验相关危害
1.物理性危害
(1)动物咬伤、抓伤：从事动物饲养与使用动物做实验，捉拿动物难免会有被咬伤事件的发生，不论伤度轻重多少，必须做到下列事项：①建立报告制度，发生事故后及时向领导报告；②接受适当治疗与防治，严重者送医院治疗；③必备急救卫生箱：箱内装有紧急救护所需要的基本物品，如棉花、纱布、胶布、消毒水、清洁剂、70％酒精、碘酒、过氧化氢溶液、抗生素等；④向有关医师与兽医师寻求协助；⑤严重受伤时需接受破伤风预防注射。
(2)针刺伤：动物实验中尖锐物品，如针头、刀具、碎玻璃等引起。针刺伤是常见的实验室感染因素，使用尖锐物品时要格外小心，针头不要重新插入针套，碎玻璃等不要用手直接接触处理。尖锐废弃物应放入特定防穿刺的垃圾袋(箱)。
(3)易燃物：实验室使用天然气等。易燃物区域禁止有明火，如吸烟等。
(4)高压气瓶：高压气瓶在高温密闭环境下容易爆炸，注意防火防爆。
(5)其他事宜。
2.化学性危害
(1)麻醉与安乐死药物。
(2)消毒药、杀虫药、清洁剂。
(3)防腐剂：如40％中性甲醛溶液等。
(4)实验药物、致癌物、致畸胎药等。
3.操作实验动物麻醉与安乐死药剂时人员安全
(1)操作实验动物麻醉或安乐死时，应同时顾及人员安全、健康及情绪影响。
(2)动物手术室应设有抽气设备。
(3)使用吸入性麻醉或安乐死术药剂，应注意是否对人员健康与安全造成伤害。例如，使用二氧化碳，对人员影响小、不燃及不具爆炸性。氟烷，安氟醚，异氟胺安定等麻醉气体，宜注意对人体健康的伤害(肝毒性)。
(4)使用乙醚麻醉某些动物(如大鼠)，不推荐作为安乐死药剂，其为易燃性，有爆炸性最好不要使用。
4.意外处理与人员安全
(1)意外事件灾害，意外事件包括化学品漏出，停电、漏电、断水，煤气溢气、通风不良，以及人员意外伤害如触电，蒸气、清洁剂和化学药品的烫伤或被动物咬伤等。
(2)天然灾害，天然灾害有火灾、水灾、台风与地震。
(3)建立实验室危机紧急通报系统。
(4)建立并严格执行标准操作程序(SOP)。
从事实验动物生产者(饲养管理、运送人员)与使用者(研究人员)，对于实验动物相关法规、环保管理、人畜共患病、麻醉与安乐死操作的卫生与安全、放射性物质及感染性物质动物实验的安全等，必须有一个整体的学习认知，并确实执行标准操作程序(SOP)，以维护环保、职业健康与安全及公共卫生。
四、安全教育与个人防护
1.安全教育 做好实验室人员的安全教育，是防止安全问题的重要措施。教育的内容可根据实验室人员素质及设施设备条件而定，并由实验室主任或高级技师负责培训。实验室的安全教育通常包括下述内容。
(1)实验室安全问题出现的原因、途径及方式。
(2)意外事故，注入、溢出等可能引起的感染，及应采取的预防措施。
(3)气溶胶污染空气引起的感染，并说明气溶胶产生的原理和物理性质，以及减少气溶胶发生的操作方法。
(4)处理感染性生物样本的原则及方法。
(5)实验室废物的危害及其处理方法。
(6)实验动物的接种、管理及尸体处理原则。
(7)实验室的合理设计。
(8)实验室事故的应急措施。
(9)有害化学试剂的贮存及应用。
(10)放射性物质的危害及使用原则。
(11)防火措施。
(12)防护服、护目镜、面罩等用品的使用方法及原则。
(13)生物安全柜的使用范围及方法。
(14)压力灭菌器、干燥箱的应用及灭菌效果监测。
(15)离心机的使用方法及事故处理。
(16)实验室的空气消毒方法及其效果监测。
(17)化学消毒剂的性质及其应用范围。
(18)其他保证安全的项目。
2.安全措施 在检测感染性标本时必须戴手套，以保护人体不受感染，手套大小必须合适。工作程序可能是复杂的，在短时间内从操作仪器、书写报告到打电话，工作人员必须想到全体人员，注意保持全体预防原则。完成感染性工作后要脱手套、洗手，手套不可重复利用或冲洗，必须消毒处理。如果感染动物血液或液体可能漏溅到黏膜时，必须戴口罩、眼镜或面罩。在化学物泄漏事故中，无论是否接触眼镜，都应注意对眼睛的保护。戴眼镜人员应注意在工作区避免接触眼镜的所有操作。
生物安全实验室工作人员必须穿戴个人防护服(工作服、实验衣)。防护服内不可放食品及个人用品，若接触传染病原体、感染动物、感染性标本、特种化学品等必须穿隔离衣、戴口罩。接触感染性标本时，应使用一次性手套。实验衣保护人体，属于污染物品，离开工作区以前必须脱去实验衣。
3.动物感染实验操作规范(animal biosafety level 1～4, ABSL-1 ～4)
(1)ABSL-1实验室一般标准操作程序
1)设立门禁限定工作人员进出并遵守生物安全手册。
2)工作前后注意洗手。
3)工作区域禁止饮食。
4)穿戴个人防护设备，禁止穿戴到非工作区域。
5)注意对样本去污及高压灭菌。
6)动物房间门需向内开并且能自动关闭。
7)注意对虫害、野生动物的防治。
(2)ABSL-2实验室要求：除满足一级要求以外，还应满足以下要求
1)人员接受处理病原训练。
2)进出实验室需管制。
3)受污尖锐物品需特别处理。
4)操作过程需有防护柜或生物安全柜。
5)动物房外张贴生物安全警告标志。
6)人员定期接种疫苗及收集血清样品监测。
7)任何程序或政策改变时需增加额外训练。
8)空气不能循环至其他动物房。
9)动物房要配有去污灭菌锅。
(3)ABSL-3实验室要求：除满足二级要求以外，还应满足以下要求
1)所有操作程序都必须在生物安全柜或其他防护装置下执行。
2)动物笼在清洗前须灭菌处理。
3)所有废弃物丢弃前必须高压灭菌处理。
4)穿戴防护服。
5)要有鞋套或消毒池。
6)动物笼具有过滤网。
7)双门走道或气室。
8)自动式洗手台或脚控制。
9)动物房门自动关闭且密封。
10)非再循环空调系统。
(4)ABSL-4实验室要求：除满足三级要求以外，还应满足以下要求
1)完全隔离的建筑物。
2)灭菌后抛弃式动物笼。
3)严格门禁制度。
4)工作人员只能由更衣室及淋浴室进出并穿着类似太空装的安全防护服。
5)所有实验衣物须高压灭菌处理。
6)双门灭菌锅烟熏室或气室。
7)门窗防震碎且密封。
8)专用的非再循环空调系统，废气需经HEPA过滤及去污或烧毁处理。
五、实验室污染事故及处理原则
实验室内由于工作人员不慎，或技术不熟练而发生的一些污染事故，必须及时采取应急措施，以免病原微生物蔓延而造成传染病流行。
1.培养物渗漏或容器破损的处理 盛有感染性标本的容器渗漏，或溅落在工作台上，或污染地面时，应以0.5％次氯酸钠或过氧乙酸浸泡的布覆盖至少1h，再用擦布擦去渗漏物，并将擦布放在污染物容器内压力灭菌。如果手和脚被微生物污染，可用碘附洗涤消毒；受污染的工作服应立即更换。
如果发生大量烈性传染病的致病菌污染，除采取以上应急措施外，必须立即封闭现场，并报主管防疫部门，请专职防疫人员参加研讨和采取相应的处理方法。若发生盛有培养物的器皿破碎，要用消毒液浸泡的布覆盖，至少半小时后才能将破碎物和用过的布放在容器中高压消毒。然后，用消毒液浸泡的布擦洗污染的台面或地面，擦布使用后也必须压力消毒。做上述处理者要戴手套。
2.事故性刺伤、划伤或擦伤的处理 经常使用注射器做实验动物接种等操作，可能无意中刺伤皮肤，造成有感染性液体的事故性注入。尤其对于毒性较强的病原菌，如SARS- CoV、AIV、炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌和乙型肝炎病毒等，可引起严重的实验室感染。一旦发生这样的意外，必须立即报告有关部门，分解不同病原体采取相应的应急措施，包括预防接种和抗生素治疗等。类似的事故必须予以较详细的登记。
其他事故，如被刀剪或破碎玻璃等划伤或刺伤时，均应先清洗伤口，并给予必要的预防注射和相应的抗生素治疗。
3.误服微生物悬液的处理 因实验操作或使用口吸吸管而误服微生物悬液并引起感染者曾有过许多报道，对于误服者必须立即用含漱、洗胃和催吐等方式处理，严重者应送往急救室，根据摄入的病原体，采取必要的预防及治疗措施，并做好事故登记。若悬液溅入眼内，应先以生理盐水冲洗，然后每隔1h以抗生素眼药水滴眼，再根据具体情况，决定有无必要做针对性的预防注射或给予丙种球蛋白。
4.装有病原体离心管破碎后的处理
(1)如果离心沉淀过程中发现离心破碎，应立即停机，并于30min后打开。假如停机后发现离心管破碎，要重新盖好盖子，30min后打开。
(2)戴上厚橡皮手套，必要时外面再套上一层塑料手套，用镊子捡出离心碎片。
(3)全部碎管和套管等应放入无腐蚀性的消毒液中浸泡24h或采用压力灭菌。
(4)离心机转筒应采用无腐蚀性的消毒液擦拭干净，擦布也需经压力灭菌。
5.气溶胶污染室内空气的处理 实验室内因操作不慎，含有感染性液体大量喷出而形
成气溶胶并污染室内空气时，室内所有人员应马上撤离污染区域，并应报告主管部门。至少在1h内任何人员均不能进入污染区。待气溶胶排出和较重的感染性微粒沉淀下来，即1h后再在安全员的监督下进行消毒。遭到气溶胶感染的人员应做相应的预防注射和抗生素等治疗。
六、工作人员的健康管理
对实验室的工作人员要有详细的病史记录，包括所有职业病、外伤和一般疾病的记录，并定期进行健康检查，做各种预防接种和结核菌素试验等。对从事麻疹、风疹、鼠疫和狂犬病病原体处理的实验室人员均需做相应的预防接种。孕妇不适宜在病毒室工作，因为怀孕期间较易感染某些病毒性疾病，且易造成流产。孕妇同样也不适宜在大剂量放射性实验室工作，否则容易发生流产、死胎或胎儿畸形。必须牢记，预防接种不能取代合格的微生物实验操作和安全防护措施；一旦发生感染，应首先考虑其是否为实验室感染。
七、灾害等危机管理
实验动物设施主要分为生产设施和实验设施。不同的实验动物设施可能发生的危机不同，处理危机的方式也不同。
1.实验动物设施可能发生的危机
(1)意外事件：意外事件包括化学品泄漏、有害气体泄漏，断水、断电、漏电、通风不良以及人员意外伤害，如触电、高温蒸气烫伤、消毒剂和化学药品的烧伤或被动物咬伤和抓伤等。
(2)天然灾害：天然灾害有火灾、水灾、台风与地震等。
(3)人为灾害：工作人员的疏忽而造成人为的灾害。
如遇到紧急事件，原则上可处理的应立即当场处理。无法处理时，立刻与主管人员联络，并迅速向有关单位通报或请求救援。
2.建立危机通知系统
(1)建立各级负责人或主管人员联络系统：包括紧急联络电话，尤其是节假日的值班人员，应特别留意。
(2)准备上级单位和相关机关单位的联系方式：包括消防队，水、电、燃气公司，医院(120)与派出所电话(1 10)。
3.意外灾害危机处理
(1)化学品泄漏：每个单位都使用不少种类的化学药品，如清洁剂、消毒剂、灭菌剂，用于洗涤饲养盒、笼架具和地板等。各实验室所使用的试剂、溶剂、酸碱剂，有的易燃、有的有腐蚀性，有蒸发性，如发生大量漏出，可导致意外伤害。各单位应该准备与自己内部所用化学品相关的处理物品与工具，包括大块棉纸抹布、海绵、肥皂水，洗涤冲刷中性水等。
(2)动物咬伤：从事动物饲养与使用动物做实验，捉拿动物难免会被咬伤，不论伤势轻重，必须做到下列事项：①向主管人员报告；②接受适当治疗与防治，严重者送往医院；③准备急救卫生箱，箱内装有急救所需要的基本物品，如棉花、纱布、胶布、消毒水、清洁剂、70％酒精、碘酒、过氧化氢溶液和抗生素等；④向有关医生与兽医报告。
(3)蒸气锅、高压灭菌锅、天然气管爆炸：这方面的灾害发生可能为意外事件，也可能与地震天然灾害同时发生。
(4)意外断电：在电力供应异常时应请电工人员或电力公司处理。每单位应都装备有紧急备用发电系统，如短期停电，紧急发电系统可暂时应付停电影响。如紧急备用发电系统无法立即启动，或为长时间停电，饲养管理人员应迅速离开动物房隔离区。
(5)断水：断水时，使用备用水，并立即通知自来水公司专职人员进行维修。平时做好维护和定时更换特殊过滤装置，并定期检验水质，以确保水质安全。
(6)空调故障：通风不良主要是空调系统当机或运转异常所造成。一般通风不良，会增加微生物在空气中传播。严重时，会导致动物缺氧死亡。平常要定期更换空气滤网，饲养人员可以用纸条在门口检查空气对流情况。空调专职人员为全天候轮班制监控作业。如发现通风不良现象，尽快联络电工或空调专职人员处理。
