在胚胎发育的过程中，具有全能性的受精卵经过一系列分裂、分化，形成不同的细胞类型，最终发育成为一个完整的生命个体。这一复杂过程中，细胞的发育路径（developmental trajectory）以及决定不同细胞命运的分子调控机制，一直以来是发育生物学中非常重要的研究内容。在胚胎发育这种动态的生物过程中，细胞与细胞之间存在着很大的异质性。这种异质性主要表现在细胞最终的命运不同，以及细胞在命运决定和建立的过程中并非同步。因此，我们需要在单细胞水平探索细胞命运决定的分子机制，这也是研究任何动态过程的必要手段。

早在2018年，Schier与Regev团队，Klein与Megason团队，在同一期的《Science》杂志上发表背靠背的研究论文，分别利用Drop-seq和inDrop两种单细胞转录组学测序技术，对斑马鱼胚胎发育过程中，一些重要时期的单细胞表达图谱进行了绘制[1, 2]。在这两项研究中，Schier与Regev团队开发了路径算法URD（以北欧神话中掌控人类命运的三女神之一命名），Klein与Megason团队利用基于DPT的算法，根据基因表达图谱，分别构建了斑马鱼在受精之后约4-24小时的发育路径。随后的几年中，陆续有团队利用单细胞转录组和空间转录组学技术，刻画斑马鱼后期发育过程中不同细胞类型的基因和空间表达图谱[3–7]。其中，值得一提的是，Schier实验室的Farrell（也就是2018年Science文章的一作）在独立之后，利用基于10x Genomics平台的MULTI-seq，在受精后14-120小时这个时间段，每12小时取时间点，绘制了50多万个单细胞的转录组特征[5]，对2018年Science文章的工作做了一个很好地补充和延续。

尽管单细胞转录组学数据对研究人员认识斑马鱼发育过程中细胞类型的产生有很大帮助，目前的单细胞转录组学图谱几乎都集中在Dome时期（受精后约4小时）之后，在此之前的基因表达研究很少。其中一个原因是斑马鱼的早期胚胎细胞处于转录沉默状态，发育主要靠母源物质维持，在发育到达1k细胞时期（受精后约3小时），合子基因组启动转录，称为合子基因组激活（ZGA）[8]。在ZGA附近，细胞和细胞之间转录组差异并不大，所以大量转录组学研究集中在斑马鱼后期发育的时间段。然而在实践中，我们能够观察到斑马鱼的胚胎细胞在ZGA附近已经有一些形态上的差异，并且过去的imaging研究表明，ZGA并不是一个同步的过程，细胞和细胞之间存在异质性[9, 10]。

如果在转录组层面，ZGA时期附近的细胞之间差别不大，那么在染色质水平，各胚胎细胞之间是否存在差异呢？如果存在，这些差异又是何时（when）、怎样（how）产生的呢？其是否与细胞的命运决定相关呢？以这些问题为出发点，来自南方科技大学生命科学学院的陈曦和靳文菲团队的成员，于2024年2月14日在Nucleic Acids Research杂志上发表了题为“The chromatin accessibility dynamics during cell fate specifications in zebrafish early embryogenesis”的研究论文，试图从染色质层面探索斑马鱼胚胎细胞第一次产生差异的时间节点和分子调控机制。

该论文利用了陈曦课题组早先开发的孔板法单细胞染色质可及性测序技术（plate-based scATAC-seq）[11, 12]，对斑马鱼胚胎在ZGA之后1小时内的多个时间点的细胞进行了染色质状态的研究，囊括了1k，high，oblong，sphere以及dome这些关键发育节点，总共10,518个胚胎细胞。

在孔板单细胞染色质可及性测序技术中，作者们利用Tn5在群体水平标记细胞核中的染色质开放区域的DNA，随后终止反应，并将细胞核进行DAPI染色，通过流式细胞术分选DAPI阳性的完整细胞核，去除细胞碎片，将单个细胞核分选到含有裂解液和带有条形码（barcode）的PCR引物的384孔板中。接下来，对每个细胞内标记的染色质开放区域的DNA进行扩增和条形码的添加，最终进行测序，并通过条形码将所得reads还原到每个单细胞，实现在单细胞水平对染色质开放状态进行测序。对每个时期的单细胞数据进行降维可视化及聚类，作者们发现斑马鱼胚胎细胞在染色质层面第一次出现离散（discrete）的细胞簇（cluster）是在受精后4.1小时左右，即胚胎从sphere到dome的过渡期。在此之前，细胞未显示可见的异质性。

图1 斑马鱼胚胎在4.1hpf第一次出现离散的细胞簇

对所有时期进行整合之后，作者们利用非负矩阵分解（nonnegative matrix factorisation）对整体的cell-by-peak矩阵进行降维，发现了5个在发育过程中具有不同动态的peak模块。过去关于早期胚胎发育的染色质可及性研究表明，染色质的开放状态，是在ZGA时期逐渐建立起来的[13–15]。与之前的发现相符，作者发现全局scATAC-seq信号在转录起始位点（TSS）和4个主要peak模块的周围随着发育逐渐升高。令人意外的是，其中一个比较特殊的模块，主要位于LTR区域，与整体scATAC-seq动态相反，随着发育过程逐渐降低。这些LTR区域所呈现出的scATAC-seq的动态的意义，仍需进一步深入研究。

图2 cell-by-peak矩阵分析

最后，由于受精后4.1小时及之后时间点的胚胎细胞呈现异质性，作者对这些细胞进行了更进一步的深入分析。降维和聚类结果揭示了四种不同的细胞状态（cluster），结合该时期胚胎的结构以及各状态的特异开放区域，作者认为这四个细胞cluster分别对应胚胎的deep layer (DEL)、enveloping layer (EVL)以及yolk syncytial layer (YSL)细胞。其中，DEL细胞又呈现两种不同状态，但不具有明显的特异开放区域。而将EVL和YSL的特异开放区域与公共数据进行对比，发现这些区域普遍距离基因的TSS较远，周围呈现低H3K4me3，高H3K4me1和H3K27ac的典型增强子（enhancer）特征。De novo转录因子motif分析揭示了对EVL和YSL细胞命运起重要作用的转录因子，例如CP2家族的Grhl3，Klf家族的Klf17和Homeodomain家族的转录因子Dharma, Mxtx2和En1a等。

图3 斑马鱼胚胎在4.1hpf后具有4种不同的细胞状态

总而言之，作者细致刻画了斑马鱼胚胎在第一次细胞命运决定时各细胞类型的染色质状态，找到了很多细胞特异性的增强子和核心转录因子，并且填补了这一时期单细胞染色质数据的缺乏，为后续的研究提供了数据基础。

哈尔滨工业大学-南方科技大学2018级联培直博生徐秋实，南方科技大学生命科学学院2021级博士生张云龙为本文的共同第一作者，南方科技大学生命科学学院副研究员陈曦与洪旎为本文的共同通讯作者。南方科技大学生命科学学院副研究员刘东、广州医科大学研究员徐玮也参与了此工作。该工作得到了科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省基础与应用基础研究、深圳市科技计划资助高等院校稳定支持计划的支持。