Dmd基因突变小鼠构建及在肌肉及免疫系统的表型验证

2024年03月11日 浏览量: 评论(0) 来源:实验动物与比较医学2024年第1期 作者:梁敏 郭洋 王津津 朱梦妍 池骏 陈艳娟 王成稷 喻智澜 沈如凌 责任编辑:lascn
摘要:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建抗肌萎缩蛋白 (dystrophin,Dmd) 基因第23号外显子点突变 的Dmd基因突变小鼠,分析并验证该小鼠在肌肉及免疫系统中的表型变化,为杜氏肌营养不良症等疾病提供评价 模型。

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建抗肌萎缩蛋白 (dystrophin,Dmd) 基因第23号外显子点突变 的Dmd基因突变小鼠,分析并验证该小鼠在肌肉及免疫系统中的表型变化,为杜氏肌营养不良症等疾病提供评价 模型。

方法 针对Dmd基因23号外显子序列特征,设计合成小向导RNA (small guide RNA,sgRNA);将Cas9 mRNA、sgRNA片段和oligo donor DNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中,并将该受精卵移植至代孕鼠后出生 获得 F0 代小鼠;F0 代小鼠通过交配获得子代小鼠后,基因型鉴定筛选得到 Dmd 基因阳性突变小鼠 (命名为 DmdMu/+小鼠)。选择 3 月龄和 9 月龄的雄性半合子 DmdMu/+小鼠 (命名为 DmdMu/Y小鼠) 和野生型 C57BL/6J 小鼠 (作为对照) 用于表型验证:称量记录活体小鼠体重,并通过悬挂实验检测小鼠肌张力;采集心脏和半腱肌,采用 HE染色法观察组织病理学变化,进一步通过蛋白质印迹法检测9月龄小鼠肌肉组织内Dmd蛋白的表达情况。利用 脂多糖诱导建立DmdMu/Y小鼠急性炎症模型,采集小鼠颌下静脉血,采用流式细胞术检测外周血中性粒细胞和单核 细胞比例变化。

结果 基因组测序和蛋白质印迹结果表明 Dmd 基因点突变小鼠 (即 DmdMu/+小鼠) 构建成功, DmdMu/+小鼠骨骼肌和心肌中未见Dmd蛋白表达,与野生型C57BL/6J小鼠相比明显下降 (P<0.05)。与背景相同的 野生型小鼠相比较,3月龄和9月龄的雄性半合子突变小鼠 (DmdMu/Y小鼠) 体重明显减轻 (P<0.01),肌张力显著 下降 (P<0.05);9月龄DmdMu/Y小鼠的骨骼肌和心肌发生肌间隙变宽等明显病变。未注射脂多糖时,与野生型小鼠 相比,3 月龄 DmdMu/Y小鼠的外周血中性粒细胞和单核细胞比例显著降低 (P<0.01);经脂多糖诱导后,3 月龄 DmdMu/Y小鼠的外周血中性粒细胞比例仍然较野生型小鼠显著降低 (P<0.01),而9月龄DmdMu/Y小鼠的外周血中性 粒细胞比例在脂多糖诱导后显著升高 (P<0.05),但较野生型小鼠仍显著降低 (P<0.01);同月龄DmdMu/Y小鼠经脂 多糖诱导后外周血单核细胞比例与野生型小鼠相比仅有偏低趋势 (P>0.05)。

结论 成功构建了Dmd基因突变小鼠 模型,证实该基因具有维系肌肉组织正常形态和肌张力等重要功能,并初步发现该基因缺失会减少外周血液中性粒 细胞比例,为后续研究杜氏肌营养不良症患者的免疫系统异变机制提供新的思路。

阅读原文:Dmd基因突变小鼠构建及在肌肉及免疫系统的表型验证.pdf

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