学术文章
弗吉尼亚大学发现全新Myh11-CreERT2-RAD小鼠可作为平滑肌细胞研究的新工具
平滑肌细胞（SMC, Smooth Muscle Cell）组成了血管和内脏器官的肌肉层，在损伤、炎症或高胆固醇血症的情况下，血管SMC可以“去分化”和增殖，若不加以控制，会导致血管内膜增生、动脉粥样硬化及其他病变。
由于去分化的SMC会严重下调特异性收缩蛋白的表达，因此在谱系追踪方法出现之前，SMC在心血管疾病中的作用一直被低估。人们利用Cre-loxP重组系统对成熟的SMC进行标记后，发现分化的SMC可产生多种细胞，类似巨噬细胞、成纤维细胞和脂肪细胞。这些结果从根本上改变了SMC的研究。
Myh11-CreERT2-Off小鼠品系被认为是SMC研究中的金标准，目前已广泛用于条件突变或谱系追踪实验。这个品系在血管和内脏SMC中发生特异性重组，表明编码平滑肌肌球蛋白重链的MYH11仍是分化SMC的最具特异性标志物。不过，遗憾的是，这种基于细菌人工染色体（BAC, bacterial artificial chromosome）的小鼠品系插入位置位于Y染色体中，因此无法对雌性小鼠进行分析。
为此，弗吉尼亚大学医学院等机构的研究人员构建了一种新的小鼠品系Myh11-CreERT2-RAD。他们在小鼠的2号染色体上插入BAC，因此可以在雄性和雌性小鼠上开展谱系追踪和基因敲除研究。这项成果发表在《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》杂志上。
图片来源：《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》 （https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/ATVBAHA.122.318160）
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员对BAC克隆RP23-151J22进行改造，在Myh11基因的起始密码子后插入Cre-ERT2表达框，产生了Myh11-CreERT2-RAD转基因小鼠品系（由赛业生物提供）。他们将Myh11-CreERT2-RAD小鼠与两种不同的荧光报告基因小鼠杂交，并通过流式细胞术和免疫荧光分析检测了SMC的特异性标记。
技术路线 01 对细菌人工染色体进行改造，构建Myh11-CreERT2-RAD小鼠 02 通过报告基因表达比较Myh11-CreERT2-RAD与Myh11-CreERT2-Off的活性 03 评估Myh11-CreERT2-RAD转基因驱动的Cre表达是否具有SMC特异性 04 评估Myh11-CreERT2-RAD小鼠在缺乏tamoxifen下的报告基因表达
研究结果 1 构建Myh11-CreERT2-RAD小鼠 研究人员首先对BAC克隆进行改造，在小鼠Myh11基因的起始密码子后插入Cre-ERT2表达框，并去除BAC载体骨架上的loxP和loxP511位点。之后将改造后的BAC注射到C57BL/6小鼠受精卵的原核中，使其随机插入基因组。然后将受精卵植入代孕母亲体内，获得携带转基因的后代。Myh11-CreERT2-RAD小鼠的构建工作由赛业生物完成。为了确定Myh11-CreERT2-RAD转基因的染色体插入位点，他们进行了靶向位点扩增分析和新一代测序，显示转基因整合在2号染色体上。 2 与Myh11-CreERT2-Off小鼠的比较 为了比较Myh11-CreERT2-RAD与Myh11-CreERT2-Off的活性，研究人员将小鼠与tdTom或eYFP荧光报告基因小鼠杂交，并在小鼠口服tamoxifen后通过共聚焦显微镜或流式细胞术评估荧光蛋白表达（图1）。他们发现，口服tamoxifen可以诱导Cre+小鼠头臂动脉的SMC表达tdTom或eYFP。细胞计数显示，头臂动脉中95%的SMC表达tdTom。 通过荧光蛋白分析，研究人员发现Myh11-CreERT2-RAD和Myh11-CreERT2-Off小鼠的报告基因表达差异小于10%。重要的是，管腔内的内皮细胞或外弹力板的外膜细胞没有检测到标志物。按性别来看，雄性和雌性Myh11-CreERT2-RAD小鼠的报告基因表达无显著差异。这些结果表明，Myh11-CreERT2-RAD转基因驱动了动脉中SMC的报告基因重组，并且与雄性Myh11-CreERT2-Off小鼠相当。 Myh11-CreERT2-RAD有效诱导了floxed tdTom报告基因重组[1] 3 荧光蛋白表达具有SMC特异性 为了确定Myh11-CreERT2-RAD转基因驱动的Cre表达是否具有SMC特异性，研究人员通过免疫荧光共聚焦显微镜检查了各种组织中的tdTom表达。他们在心脏的冠状血管中观察到tdTom表达，并在肺动脉和肺周细胞以及视网膜和斜方肌的小血管和周细胞中检测到tdTom表达。通过这些数据，他们认为Myh11-CreERT2-RAD转基因在血管和内脏SMC及周细胞中驱动Cre重组的方式与Myh11-CreERT2-Off类似。 4 转基因小鼠表现出不依赖tamoxifen的报告基因重组 之前有报道称，许多CreERT2小鼠品系表现出不依赖tamoxifen的重组。为了确定Myh11-CreERT2-RAD或Myh11-CreERT2-Off小鼠是否会出现这种情况，研究人员检测了未口服tamoxifen的转基因小鼠中的tdTom或eYFP表达。他们发现，在缺乏tamoxifen的情况下，两种转基因小鼠均零星表达了tdTom，但eYFP表达未检测到（图2）。 他们推测，tdTom报告基因的重组阈值较低，因此与包括eYFP在内的其他报告基因相比，特别容易受到CreERT2本底重组的影响。后续分析发现，这种重组是SMC特异性的，只有在Myh11-CreERT2-RAD或Myh11-CreERT2-Off转基因存在时才会发生，原因可能是一部分的CreERT2蛋白在没有tamoxifen的情况下被转运到了细胞核。这种渗漏取决于floxed基因的重组阈值，需要对每个基因进行严格评估。 Myh11-CreERT2-RAD和Myh11-CreERT2-Off可诱导不依赖tamoxifen的报告基因重组[1] 
研究结论 总的来说，这项研究构建并验证了一种新的常染色体Myh11 Cre驱动的小鼠Myh11-CreERT2-RAD。它的性能与Myh11-CreERT2-Off小鼠类似，但优点是可以同时研究雄性和雌性小鼠。这种小鼠品系是一种有价值的新工具，有助于发现健康和疾病状态下SMC功能的性别差异。
原文检索： [1]Deaton RA, Bulut G, Serbulea V, et al. A New Autosomal Myh11-CreERT2 Smooth Muscle Cell Lineage Tracing and Gene Knockout Mouse Model-Brief Report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Feb;43(2):203-211. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318160.
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