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目的 利用簇状规则间隔回文重复序列（ＣＲＩＳＰＲ） ／ Ｃａｓ９ 基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤 成纤维（ＮＭＲ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＮＳＦ）细胞 ＨＩＦ⁃１α 基因，为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制 提供体外细胞模型。

方法 针对裸鼹鼠 ＨＩＦ⁃１α 基因的 １ ～ ４ 号外显子区域设计 ４ 对 ｓｇＲＮＡ 序列，并成功构建表 达质粒。 筛选得到最优 ｓｇＲＮＡ 后，转染 ＨＥＫ⁃２９３Ｔ 细胞收集上清液测定病毒滴度。 前期用 ｐＬｅｎｔｉ⁃Ｃａｓ９（ ｂｌａｓｔ）病毒 感染 ＮＳＦ 细胞，后用制备的 ＨＩＦ⁃１α⁃ｓｇＲＮＡ 病毒感染表达 Ｃａｓ９ 蛋白的 ＮＳＦ 细胞。 经药筛后观察荧光表达，同时提 取细胞 ｇＤＮＡ 和蛋白。 通过 Ｔ７Ｅ１ 酶和 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 检测 ＮＳＦ 细胞中 ＨＩＦ⁃１α 基因变化及蛋白表达情况。

结果 Ｓａｎｇｅｒ 测序显示，所设计的 ｓｇＲＮＡ 成功插入到 ｐＸ４５９ 和 ｐＫＬＶ２⁃Ｕ６⁃ｓｇＲＮＡ２ 载体上，序列验证正确，重组质粒构建 成功；Ｔ７Ｅ１ 酶切实验成功切除 ３ 条带，ｓｇＲＮＡ 的打靶效率为 ５４％，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 结果表明，经药筛后的裸鼹鼠 ＮＳＦ 细胞 ＨＩＦ⁃１α 基因敲除成功，蛋白水平显著降低（Ｐ ＝ ０.００１９）；且未发现 ＨＩＦ⁃１α 敲除细胞形态的明显变化，基因敲 除对细胞增殖能力无明显影响。

结论 成功构建靶向裸鼹鼠 ＨＩＦ⁃１α 基因的 ＣＲＩＳＰＲ／ Ｃａｓ９ 质粒，且质粒靶向敲除 ＨＩＦ⁃１α 基因功能验证成功，将有利于裸鼹鼠耐低氧机制研究，并为人类缺氧相关疾病防治提供理论依据。

阅读原文：基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统构建裸鼹鼠ＨＩＦ⁃１α基因敲除质粒及其功能验证.pdf