作为碱基编辑和先导编辑的发明人，刘如谦在最近举行的美国基因与细胞治疗学会2024年年会（ASGCT 2024）上，做了题为：Continuous evolution of genome editing systems for targeted gene-sized DNA integration in mammalian cells 的报告，介绍了其在基因组编辑领域的新成果——在不产生DNA双链断裂的情况下，在人类细胞中实现大基因的高效、位点特异性整合。

这项研究成果于2024年6月10日发表在了 Nature Biomedical Engineering 期刊，论文题为：Efficient site-specific integration of large genes in mammalian cells via continuously evolved recombinases and prime editing。

该研究利用噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，将丝氨酸整合酶Bxb1迭代进化了数百代，克服了PASSIGE技术效率低的问题，可对长达10kb的大片段DNA实现高水平整合（效率可达35%），相比PASTE技术，将大片段DNA的位点特异性整合效率提高了一个数量级。

据悉，这是迄今为止在哺乳动物细胞中实现的最高效率的RNA编程的基因大小的基因组整合（之一），并且这一效率已经超过了挽救各种功能丧失基因突变的遗传病所需。

导致人类疾病的基因突变范围从单碱基突变到大片段DNA的缺失、倒位、易位和重复。许多遗传病与特定基因内的多种功能确实突变相关，例如，ABCA4基因的500多种突变类型会导致Stargardt病，PAH基因的1000多种突变类型会导致苯丙酮尿症，而CFTR基因的2000多种突变类型会导致囊性纤维化。

对于这些一个基因的大量不同突变引起的遗传病，将全长的正确基因整合到其内源性位点，理论上就可以这种遗传病的所有患者带来一种通用治疗策略。

对于这些疾病，不可能去开发数百种乃至上千种基因疗法来治疗，将整个基因或其中某些外显子整合到致病位点或基因组安全港位点，而不会产生DNA双链断裂（DSB），是一种更具潜力的治疗方式。

然而，在人类基因组中如何实现高效、位点特异性地整合大片段DNA，且不依赖DNA双链断裂（DSB），是一个尚未解决的难题。

2021年12月，刘如谦团队在 Nature Biotechnology 期刊发表了论文，开发了双先导编辑（TwinPE）技术，并通过将先导编辑与位点特异性丝氨酸整合酶结合，开发了PASSIGE技术（prime-assisted site-specific integrase gene editing，先导编辑辅助的位点特异性整合酶基因编辑）。

PASSIGE技术在不产生DNA双链断裂的情况下，能够将长达数千碱基的DNA整合到哺乳动物基因组中特定位置，单次转染的整合效率可达6.8%。但这一效率显然还不够高。

在这项发表于 Nature Biomedical Engineering 期刊的最新研究中，刘如谦团队利用他十几年前开发的噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，将丝氨酸整合酶Bxb1迭代进化了数百代，克服了PASSIGE技术效率低的问题，可对长达10kb的大片段DNA实现高水平整合（效率可达35%）。

具体来说，该研究显示，噬菌体辅助连续进化（PACE）增强了PASSIGE， PASSIGE将先导编辑的可编程性与整合酶精确整合超过10kb的大片段DNA的能力相结合。进化和改造的丝氨酸整合酶Bxb1的变体（evoBxb1、eeBxb1）在具有预先安装了整合酶附着位点的人类细胞系中介导了高达60%的供体DNA片段的整合（是野生型Bxb1的3.2倍）。

在基因组安全港位点和治疗相关位点的单次转染实验中，使用eeBxb1的PASSIGE使靶基因整合效率平均达到23%（是野生型Bxb1的4.2倍）。值得注意的是，在原代人成纤维细胞中，其在多个位点的整合效率超过30%。

2022年11月24日，麻省理工学院的 Omar Abudayyeh、Jonathan Gootenberg 等人在 Nature Biotechnology 期刊发表论文。

该研究在CRISPR的基础上开发了一种名为PASTE（Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements）的新技术，PASTE技术是在Cas9切口酶（nCas9）和逆转录酶的基础上融合了丝氨酸整合酶，可向哺乳动物及人类细胞中定点整合长达36kb的DNA长片段。

PASTE技术的两位发明人 Omar Abudayyeh 博士和 Jonathan Gootenberg 博士曾是CRISPR基因编辑先驱张锋教授的研究生，现为麻省理工学院（MIT）的研究员。他们二人创立了基于PASTE技术的生物技术公司Tome Biosciences，2023年12月，该公司宣布完成2.13亿美元融资（A轮+B轮）。

刘如谦团队的这项新研究显示，使用了evoBxb1或eeBxb1的升级版PASSIGE，位点特异性整合效率比PASTE平均高出9.1倍和16倍。

总的来说，这项最新研究表明，利用连续进化的整合酶的PASSIGE技术是哺乳动物细胞中基因靶向整合的一种异常有效的方法。