Impact factor: 13（2022）

Published online：2023-7-5 

研究背景

神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是一种儿童交感神经系统肿瘤。尽管近年来神经母细胞瘤的治疗取得了显著的进展，但仍有约一半的神经母细胞瘤病例是高风险的，其总体生存率很低。

甲羟戊酸途径的转录激活与高风NB代谢相关，维持NB细胞的增殖和存活；阻断甲羟戊酸途径可抑制细胞代谢和生长，触发细胞凋亡。甲羟戊酸途径主要包括胆固醇分支和非固醇异戊二烯分支。

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)是甲羟戊酸途径胆固醇分支的关键酶，他汀类药物是一类靶向结合HMGCR并抑制其活性的降胆固醇药物，但他汀类药物会激活胆固醇合成的负反馈，因此需要寻找新药物阻断该负反馈途径。

已有报道表明咖啡因可以阻断肝癌细胞中内质网应激诱导的固醇调节元件结合转录因子 2（SREBP2）的激活，从而降低胆固醇合成，在NB治疗过程中咖啡因或许发挥相似的作用。本研究通过体内外实验探讨了在他汀类药物治疗NB时加入咖啡因对抗肿瘤效果的影响。 

研究结果

1.靶向甲羟戊酸途径对体内外高风险NB均具有显著疗效

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）是甲羟戊酸途径的第一个关键酶，它催化将HMG-CoA转化为甲羟戊酸，他汀类药物（辛伐他汀、匹伐他汀）通过抑制HMGCR降低胆固醇的合成，从而调控甲羟戊酸途径。

在体外试验中，研究者发现辛伐他汀和匹伐他汀对神经母细胞瘤细胞具有生长抑制作用（图A-C）。研究者进一步进行了小鼠体内实验，使用辛伐他汀治疗1月龄TH-MYCN转基因小鼠（高危型神经母细胞瘤动物模型，40mg/kg，隔日灌胃，共90天）。结果发现与溶剂对照组小鼠相比，辛伐他汀治疗组显著降低了肿瘤发生率，提高了TH-MYCN小鼠的总生存率（图D）。

综上，甲羟戊酸途径可调节TH-MYCN小鼠模型中肿瘤生长，是高风险神经母细胞瘤的潜在治疗靶点。 

2.甲羟戊酸途径的非固醇分支促进NB细胞的生长 

甲羟戊酸途径可分支到各种生物合成途径，产生固醇和非固醇甲羟戊酸衍生物，非固醇反应生成产物法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，FPP）和香叶基香叶基焦磷酸酯（Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP），用于异戊二烯化和激活RAS、RHO和RAB家族蛋白(图A)。

为了确定FPP或GGPP介导的异戊烯基化是否有助于NB细胞的存活和增殖，研究者分别用FTI-277(FPP抑制剂)和GGTI-298（GGPP抑制剂）处理NB细胞，分别阻断FPP和GGPP介导的异戊烯基化。结果发现FTI-277处理对细胞增殖无显著影响，而GGTI-298处理显著抑制细胞增殖。通过后续研究发现甲羟戊酸和GGPP部分消除了辛伐他汀的对TH-MYCN转基因小鼠的肿瘤生长抑制作用。

综上，表明甲羟戊酸途径的非固醇GGPP分支对于NB细胞的生存和生长至关重要。 

3.甲羟戊酸途径的胆固醇分支促进NB生长 

FPP转化为角鲨烯（Squalene）是利用甲羟戊酸合成胆固醇的第一个关键步骤，由法尼基二磷酸法尼基转移酶1(FDFT1)催化。研究者对一组NB患者的基因表达谱进行数据分析，发现FDFT1的高表达与高风险和患者预后不良相关。

此外，研究者使用两个表达针对FDFT1基因不同区域的shRNA序列的慢病毒载体shFDFT1-25和shFDFT1-28来敲低FDFT1的表达，结果发现敲低FDFT1表达显著抑制了NB细胞的增殖。与细胞生长数据一致，敲低FDFT1表达能显著抑制BE(2)-C细胞系(一种人类神经母细胞瘤细胞系)异种移植瘤小鼠模型（Cell line-derived xenograft, CDX）荷瘤小鼠肿瘤的生长，并延长荷瘤小鼠的生存期。研究者进一步过表达鲨烯环氧酶(SQLE，胆固醇分支的限速酶)，发现过表达SQLE增加了细胞胆固醇水平，并增强了NB细胞增殖。

综上，这表明胆固醇分支相关酶是高风险NB的潜在治疗靶点。 

4.辛伐他汀下调FOXM1基因

研究者使用溶剂（DMSO）、辛伐他汀(5mmol/L)或辛伐他汀(5mmol/L)+甲羟戊酸(2mmol/L)处理SMS-KCNR细胞（含有转录因子MYCN基因的扩增的NB细胞系）30小时，对基因表达谱进行分析鉴定到601个辛伐他汀应答基因，其中275个基因上调，326个基因下调，下调的基因与有丝分裂和交感神经系统发育的基因高度重合。通过qRT-PCR验证，发现辛伐他汀处理下调了FOXM1基因表达（转录因子，与细胞有丝分裂周期相关），并发现通过补充甲羟戊酸可完全恢复FOXM1基因的表达，表明辛伐他汀通过阻断甲羟戊酸途径来抑制细胞有丝分裂过程。 

5.FOXM1调节NB细胞对辛伐他汀的敏感性 

研究者构建了3株过表达FOXM1的NB细胞系（BE(2)-C、SK-N-DZ、SHEP1），发现FOXM1过表达增加细胞周期蛋白B1（CCNB1）的表达（图A），并赋予了细胞对辛伐他汀的耐药性(图B)；相反，通过shRNA慢病毒载体敲低FOXM1表达使BE(2)-C细胞对辛伐他汀敏感(图C、D)。

研究者使用BE(2)-C CDX模型进行体内药敏实验，将荷瘤小鼠随机分为4组（n=5），分别给予溶剂、硫链丝菌素(FOXM1i，50mg/kg)、辛伐他汀（50mg/kg）、硫链丝菌素和辛伐他汀联合，每周用药6天，共50天。与溶剂对照组相比，单独使用硫链丝菌素或辛伐他汀显著降低了肿瘤的生长并延长了荷瘤小鼠的生存期(图F），联合治疗进一步降低了肿瘤的发病率和死亡率(图G)。 

移植瘤切片的免疫组化染色结果显示，硫链丝菌素或辛伐他汀单独诱导了显著的细胞凋亡水平(图H），药物组合进一步增加了细胞凋亡水平(图I）。

6.他汀类药物诱导甲羟戊酸途径的反馈反应 

SREBP2主要负责调节甲羟戊酸途径固醇分支中多种酶的表达（包括HMGCR）。当胆固醇水平低时，SREBP2被激活并转移到细胞核，促进胆固醇合成相关基因的转录。使用辛伐他汀处理NB细胞系，可导致SREBF(SREBP编码)靶基因的上调，补充甲羟戊酸后这种上调被取消，表明他汀诱导的反馈反应是通过抑制HMGCR触发的。

免疫印迹分析发现敲低SQLE(胆固醇分支的限速酶)诱导HMGCS1（甲羟戊酸途径限速酶之一）和FDFT1表达上调(图J)，表明阻断胆固醇生物合成是触发甲羟戊酸途径反馈激活的主要机制。 

7.咖啡因抑制了他汀药物诱导的反馈反应 

他汀药物诱导的甲羟戊酸途径的反馈激活削弱了其抗肿瘤作用，使用阻断反馈反应的药物可以增强基于他汀类药物的癌症治疗效果。已有报道表明咖啡因可以阻断肝癌细胞系中内质网应激诱导的胆固醇相关酶SREBP2 的激活，在NB治疗过程中，咖啡因或许可能发挥相似的作用，因此本研究选用咖啡因与他汀类药物联用进行体内外药物敏感实验。

在NB细胞系中，咖啡因抑制了他汀诱导的反馈反应，降低了甲羟戊酸途径酶在mRNA和蛋白水平的上调(图B、C)。

 研究者构建了COGN-519x（具有MYCN扩增的化疗耐药4期神经母细胞瘤）患者异种移植模型（Patient-derived xenograft，PDX）进行体内药效实验，将荷瘤小鼠随机分为5组（n=6），分别给予溶剂、含咖啡因饮用水(咖啡因0.4g/L,每日80mg/kg体重)、辛伐他汀50mg/kg灌胃或辛伐他汀(50mg/kg)+咖啡因饮用水(0.2或0.4g/L，40或80mg/kg)联合处理，治疗从接种当天开始，到接种后第38天结束。与体外数据一致，咖啡因对荷瘤小鼠肿瘤生长无显著影响，而单独使用辛伐他汀显著降低了荷瘤小鼠肿瘤生长，延长了荷瘤小鼠的生存期(图A、B)；对于联合治疗，40mg/kg/d的咖啡因处理未显著增强辛伐他汀的疗效，但80mg/kg/d的咖啡因处理显著增强了辛伐他汀的疗效。 

免疫组化结果显示，辛伐他汀及其与咖啡因合用显著增加荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡(图C、D)。 

综上，这些发现表明辛伐他汀和咖啡因的联合可有效治疗MYCN扩增神经母细胞瘤。 

8.咖啡因与辛伐他汀具有协同作用 

咖啡因在结构上与腺苷相似，主要作为腺苷受体的拮抗剂发挥作用，通过联合用药发现腺苷显著抑制了咖啡因的作用，恢复了他汀诱导的甲羟戊酸途径酶的反馈激活（图A、B），拮抗腺苷受体是咖啡因与辛伐他汀协同作用的主要机制。 

 A2A腺苷受体对腺苷的亲和力最高，其拮抗剂为伊曲茶碱（KW-6002）。免疫印迹分析显示，与咖啡因一样，KW-6002降低辛伐他汀诱导的CHO-K1细胞中Srebp2的激活和IMR5细胞（一种NB细胞）中ACSS2和HMGCS1的上调(图C、D)。 

 单剂量联合实验表明，KW-6002与辛伐他汀协同抑制NB细胞系(图E)和NB PDX荷瘤小鼠肿瘤的生长(图F)。因此，在咖啡因和他汀类药物联合治疗NB患者时应禁止腺苷的摄入。 

结论

本研究发现，甲羟戊酸途径（包括胆固醇和非固醇分支）对神经母细胞瘤细胞的生长至关重要，辛伐他汀通过阻断胆固醇合成途径抑制肿瘤生长。

本研究发现FOXM1抑制剂及咖啡因与他汀类药物治疗NB时具有协同作用，FOXM1表达与他汀类药物的抗性有关，通过敲低FOXM1表达可提高NB细胞对他汀药物的敏感性；咖啡因通过阻断他汀类药物诱导的甲羟戊酸途径的负反馈来增强其抗肿瘤效果。这些发现为开发新的联合治疗策略提供了科学依据，有助于改善高风险神经母细胞瘤患者的治疗结果。 

 PDF原文【PMID 37057874.pdf】 

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REFERENCE：Tran GB, Ding J, Ye B, Liu M, Yu Y, Zha Y, Dong Z, Liu K, Sudarshan S, Ding HF. Caffeine Supplementation and FOXM1 Inhibition Enhance the Antitumor Effect of Statins in Neuroblastoma. Cancer Res. 2023 Jul 5;83(13):2248-2261. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-22-3450. PMID: 37057874; PMCID: PMC10320471.