Impact factor: 7.0（2023）

Published online：2023-11-28

研究背景

肝细胞癌( Hepatocellular carcinoma，HCC )是全球第六大最常见的癌症，尽管早期HCC可以通过手术切除、肝移植或消融治疗，但多数患者在确诊时已经处于晚期，难以手术切除，导致五年生存率相对较低。因此，需要探索更有效的治疗靶点。

核苷甲基转移酶(methyltransferase-like proteins, METTL)是一类具有甲基转移酶活性的蛋白质，其在肿瘤生长、迁移和侵袭中起着重要作用，METTL9被报道为多种癌症中的致癌基因。

铁死亡是一种铁依赖性的脂质过氧化物驱动的细胞死亡形式。溶质载体家族7成员11 ( SLC7A11 )是铁死亡关键分子之一，其功能是输入胱氨酸进行谷胱甘肽生物合成和抗氧化防御，起到负调控铁死亡的作用。

尽管已有研究表明METTL9在其他癌症中的致癌作用，但在HCC中的作用尚不明确。此外，SLC7A11调节铁死亡在HCC的预后中的影响也不清楚。因此，本研究通过控制变量法敲低/过表达METTL9基因及SLC7A11基因，探究METTL9-SLC7A11轴对HCC进展的影响。

研究结果

1.METTL9在HCC中表达上调与患者不良预后相关

研究者通过分析癌症基因组图谱数据库( The Cancer genome atlas，TCGA )、基因表达数据库（Gene expression omnibus，GEO）等数据库发现METTL9的表达水平在包括HCC在内的肿瘤组织中普遍上调，且METTL9的表达上调与HCC恶性程度相关（图F）。肝癌组织芯片的免疫组化实验结果显示，与癌旁组织相比，METTL9在肝癌组织中的表达显著上调(图K 、L)，并且METTL9高表达的患者显示出显著较短的总生存期(图M )。

2.METTL9的敲低抑制了HCC在体内外的恶性进展

研究者发现METTL9在HepG2和PLC-8024细胞（均为人肝癌细胞）中的表达水平较高，通过两种干扰病毒（shM9#1和shM9#2）构建了稳定敲低METTL9的HepG2和PLC-8024细胞系，结果发现METTL9的敲低显著抑制了细胞活力(图A 、B)、减少了细胞克隆形成的数量(图C )、降低了肝癌细胞的增殖率(图D )、显著抑制了细胞的迁移和侵袭能力(图E 、F)。

研究者通过两种干扰病毒（sh#3和sh#4）构建了稳定敲低METTL9的Hepa1-6细胞系（小鼠肝癌细胞），并使用NSG小鼠构建了同源移植小鼠模型（Syngeneic）。研究结果发现敲低METTL9可明显减慢肝癌细胞的肿瘤生长(图G 、H)；免疫组化结果显示，与METTL9敲低组相比，对照组HCC组织中Ki67阳性细胞比例和METTL9表达水平更高(图J - L)。通过向NSG小鼠尾静脉注射稳定敲低METTL9的Hepa1-6细胞构建肺转移瘤模型，结果发现METTL9的敲低显著减少了肺转移结节的数量（图M-O）。

3.METTL9的过表达促进HCC在体内外的恶性进展

研究者构建了METTL9过表达的Huh7（人肝癌细胞）细胞系，发现METTL9过表达显著增强了Huh7细胞的细胞活力、克隆形成、增殖、迁移和侵袭的能力。

研究者将METTL9过表达的Huh7细胞和对照载体细胞注射到NSG小鼠体内，结果发现METTL9过表达组肿瘤体积和肿瘤显著增加；METTL9过表达组中Ki67阳性细胞比例相比对照组显著增加。

4.METTL9通过调控铁死亡影响肝癌进展

SLC39A和SLC30A家族基因（金属离子转运蛋白）是METTL9调控的主要底物，通过对这两个家族基因进行了KEGG通路富集分析，发现两组富集分析结果中均出现了铁死亡信号通路。

研究者通过流式细胞术检测了与铁死亡密切相关的脂质过氧化和脂质ROS水平，结果显示METTL9敲低的HepG2细胞中，脂质过氧化的平均荧光强度( MFI )和相对脂质ROS水平显著增加，这些作用随着铁死亡诱导剂 Erastin的加入而更加明显（图C、D）；而在过表达METTL9的Huh7细胞中 MFI 和相对脂质ROS水平得到了抑制（图E、F）。

为了研究METTL9是否通过介导铁死亡诱导HCC进展，研究者在体外用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1 )处理METTL9敲低细胞和铁死亡诱导剂Erastin处理METTL9过表达细胞。结果显示敲低METTL9对HepG2细胞活力、迁移和侵袭能力的抑制作用可以被Fer-1恢复(图K、L )。相反，Erastin能够抑制METTL9过表达诱导的Huh7细胞增殖、迁移和侵袭(图M 、N)。

研究者进一步在体内实验中检测了铁死亡抑制剂Liproxstatin-1 ( Lip-1 )给药对肿瘤生长的影响，结果显示Lip-1部分恢复了因METTL9敲低组(图O 、P)引起的的肿瘤体积、重量的减小。

5.SLC7A11是METTL9介导的肝癌细胞铁死亡的主要下游分子

研究者通过多数据分析发现了SLC7A11和谷胱甘肽过氧化物酶4 ( Glutathione peroxidase 4，GPX4 )这两个与铁死亡相关的关键分子。通过敲低或增高METTL9的表达，发现METTL9和GPX4之间无明显相关，而METTL9和SLC7A11之间呈显著正相关，表现为在HepG2细胞系中敲低METTL9后，SLC7A11的mRNA和蛋白水平均显著下调，在Huh7细胞系中过表达METTL9后，SLC7A11的mRNA和蛋白水平均上调(图C 、D)。

为了验证METTL9介导的促肿瘤作用主要依赖于SLC7A11，研究者在稳定敲低METTL9的HepG2细胞中过表达SLC7A11，在稳定过表达METTL9的Huh7细胞中敲低SLC7A11。结果发现在HepG2细胞中，过表达SLC7A11部分挽救了METTL9敲低引起的细胞活力和生长抑制；在Huh7细胞中，SLC7A11的敲低抑制了METTL9过表达引起的促癌细胞生长能力（图I）。

6.抑制METTL9在肝癌中的临床意义

为了评估METTL9是否可以作为HCC的潜在治疗靶点，研究者使用NSG小鼠构建病人来源的异种移植( Patient-derived tumor，PDX )肿瘤模型进行实验（F3~F4代），瘤内注射脂质体包裹的METTR干扰质粒（20ug，每3天1次，共20天）。与对照组相比，METTL9的沉默导致荷瘤小鼠肿瘤体积、重量显著下降(图C 、D)；与对照组相比，METTL9沉默的肿瘤中Ki67阳性细胞的百分比显著降低(图E - G)。

结果表明靶向敲低METTL9可以有效抑制肿瘤生长和细胞增殖，可作为HCC治疗的一个有价值的靶点

结论

本研究发现METTL9在肝癌组织中的表达水平普遍上调，且其高表达与患者的不良预后相关，通过敲低METTL9可以显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的能力。本研究还发现METTL9可调节铁死亡相关基因SLC7A11的表达，SLC7A11的过表达会抑制癌细胞铁死亡，从而促进HCC的发展。

该研究揭示了METTL9通过调节SLC7A11表达来影响肝癌中的铁死亡过程，为肝癌的治疗提供了新的靶点和理论基础。

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南昌乐悠生物科技有限公司是一家专业从事肿瘤动物模型构建及抗癌新药临床前药效评价的国家高新技术企业，已经为包括小分子靶向药、大分子靶向药（包括ADC）、溶瘤病毒、细胞药物（TIL、γδT）等多种抗癌新药研发提供了有力的支持，其中部分药物已经进入临床试验申请(IND)阶段。 

REFERENCE：Bi F, Qiu Y, Wu Z, Liu S, Zuo D, Huang Z, Li B, Yuan Y, Niu Y, Qiu J. METTL9-SLC7A11 axis promotes hepatocellular carcinoma progression through ferroptosis inhibition. Cell Death Discov. 2023 Nov 28;9(1):428. doi: 10.1038/s41420-023-01723-4. PMID: 38017014; PMCID: PMC10684523.