一、实验目的

练习取出果蝇等幼虫唾腺的技术和制作唾腺染色体标本的方法。同时，根据唾腺染色体上带纹的形态和排列识别不同的染色体，也是进一步研究和鉴别果蝇染色体结构变异的有用方法之一。

二、果蝇唾腺染色体的有关知识

1.发现

1881年，意大利的细胞学家巴尔比尼(Balbiani)在双翅目昆虫摇蚊幼虫的唾腺细胞间期核中发现了一种巨大的染色体，由于存在于唾腺细胞中，所以又称为唾腺染色体。1933年，美国学者贝恩特(Painter)等又在果蝇核其它双翅目昆虫的幼虫唾腺细胞间期核中发现了巨大染色体。这种染色体宽约5μm，长400μm，相当于普通染色体的100-150倍，因而又称为巨大染色体。

2.原因

(1)染色体螺旋化程度不高。

(2)果蝇幼虫的唾腺细胞在发育过程中，细胞核内的DNA多次复制，但细胞、细胞核不分裂，复制后的染色单体DNA也不分开，形成了多线染色体。

(3)同源染色体相互靠拢在一起呈现一种联会状态，使其比一般的体细胞染色体粗大。

3.基本概念

核内有丝分裂：不伴随核分裂和细胞分裂(cell division)的染色体分裂。

核内复制;不伴随细胞内核分裂的染色体复制现象。

体联会：唾腺细胞中的染色体复制后，所有同源染色体一直处于紧密配对的前期状态，如同减数分裂的联会，这种现象称为体联会。

4.果蝇的染色体组成

由于在唾腺细胞中8条染色体之间以着丝粒相互连结在一起形成染色盘或异染中心和同源染色体之间的假联会，经减性染料染色后，可以观察到一个染色较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的5条染色体臂。在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同的者写，被称为明带和暗带的横纹，这些横纹的位置、宽窄、数目都具有物种的特异性，不同物种，不同染色体的不同部位形态和位置是固定的，因此根据染色体各条臂带纹特征和各条臂端部带纹的特征能准确识别各条染色体。在染色体臂上还可看到某些带纹通过染色体的界旋、膨大形成的疏松区和巴尔比尼环，其富含转录出来的RNA ，因此不着色，是基因活动的区域。在个体发育的不同阶段，疏松区或巴尔比尼环在染色体上出现的部位不同，因此可以研究基因的表达，开展各种染色体变异的研究等等。

果蝇共有4对染色体。其中一对为性染色体(XY或XX)，XX染色体为顶端着丝粒染色体，呈杆状，Y染色体为“J”形;第二对、第三对染色体均为中央着丝粒染色体，呈“V”形;第四对染色体短小，为顶端着丝粒染色体，呈点状，附在染色盘边缘。由于唾腺染色体的假联会，X染色体的一端在异染中心上，另一端游离;而第二对、第三对染色体着丝粒在中央，可以从异染中心呈“V”字形向外伸展出四条臂(2L、2R、3L、3R)，Y染色体着丝粒附近的异染色质参与了染色中心的形成，所以理想的片子，不管雌雄果蝇的唾腺细胞在显微镜下均可见五条长臂(X、2L、2R、3L、3R)和一条短臂(第四条染色体臂不易观察)。雄果蝇唾腺细胞中的X染色体臂比雌果蝇的稍细。在染色体臂上可观察到许多明暗相间的带。

(1)果蝇染色体有102个区，每个区又有A—F六个亚区，每个亚区又有1,2,3……等亚亚区。

(2)疏松区有许多灯刷状物质(灯刷染色体)

(3)唾腺染色体的末端有不同的特征，可以借此来鉴别各条染色体。

5.特点

(1)巨大;

(2)体联会现象决定了染色体只有半数;

(3)各个染色体中异染色质多的着丝粒部分相互靠拢形成染色中心;

(4)横纹有深浅、数目、疏密的不同，各自对应排列，这意味着基因的排列，具有种的特异性。

(5)多线染色体(与中期高度螺旋的染色体相区别)若有缺失、易位、倒位、重复等现象，很容易在唾腺染色体上识别出来。

三、幼虫的培养

发育充足、肥大的三龄幼虫，唾腺和唾腺细胞发育良好。利用这样的唾腺细胞才能制备出理想的染色体玻片标本。因此要求培养基营养丰富，含水量较高，比较松软，发酵良好。

将果蝇放入培养瓶中(果蝇不应过多，半磅牛奶瓶10对左右)于15-18℃的稍低温度条件下培养，接种12小时后，将成虫移出，控制成虫的排卵持续时间，以免产生过多的卵(要求每cm2培养基表面20-40只幼虫)，一龄幼虫出现后，每天在培养基表面滴加2-4.5%的酵母液或鲜酵母。2-3龄幼虫应滴加10%左右的酵母液，滴加的量以覆盖在培养基表面薄薄一层为宜。待三龄幼虫大量爬出培养基时，也可将培养瓶移至3-5℃冰箱中进行低温处理，不让其化蛹。这样的幼虫活动慢，易解剖出唾腺，而且可以获得染色体分散良好的制片。

四、实验步骤

1.剥离唾腺： 在一干净的载玻片上滴一滴生理盐水，选择行动迟缓、肥大、爬在瓶壁上即将化蛹的三龄幼虫，或者选择经低温处理的果蝇三龄幼虫置于载玻片上。每只手各持一个解剖针，在解剖镜下进行操作。由于果蝇的唾腺位于幼虫体前1/3-1/4处，所以左手持解剖针按压住虫体后端三分之一的部位，固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器部位，适当用力向右拉唾腺腺体随之而出。唾腺是一对透明的棒状腺体，外有白色的脂肪组织(不透明)。去除幼虫其它组织部分，并把唾腺周围的白色脂肪剥离干净。

2.解离： 在唾腺组织上滴一滴1NHCl，解离1-2min ，以松软组织，利于染色体的分散。

3.染色： 吸去 HCl，用水冲洗2-3次后滴加醋酸洋红染液染色10min。

4.压片： 染色完成后，盖上干净的盖片，并覆一层滤纸。将片子放在实验台上，用大拇指用力压住，并横向揉几次。(注意不要使盖片移动，用力和揉动是一个方向，不能来回揉。)

5.镜检：

流程：解剖唾腺→转到载玻片上→加1N Hcl酸解1min →吸去HCl→水洗→醋酸洋红染色10min →盖片、压片→镜检

五、注意事项

1.一定加生理盐水，否则唾腺易干。

2.将脂肪组织清除干净。

3.水不可太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。

4.染色时间不可过长，否则背景也着色。

5.压片时要揉。

6.染色完以后，将旧的染色液吸去，加新的染色液，再压片。

所需药品及材料

三龄幼虫 0.7%生理盐水 1NHCl 碱性品红 解剖镜 解剖针 吸水纸