遗传疾病是指由于遗传物质的改变导致的疾病，能够通过生育遗传给后代，是困扰人类健康的一类重要疾病。彻底根治遗传疾病的方法是通过基因治疗的手段在生殖细胞中修复改变的遗传物质，并将正确的遗传物质传递给下一代，产生健康的个体，从而在人群中彻底清除遗传缺陷。然而，目前存在的基因修饰手段不能有效地在生殖细胞中进行遗传编辑。

12月5日，国际著名学术期刊《细胞研究》Cell Research在线发表了中科院上海生科院生化与细胞所李劲松研究组和吴立刚研究组以及北京大学汤富酬研究组的一项合作研究，研究人员利用CRISPR-Cas9技术在小鼠的精原干细胞中修复了遗传缺陷，产生了完全健康的后代。这项研究为人类基因治疗提供了一个新的思路。

CRISPR-Cas9技术是利用一段与靶序列相同的单导向RNA来引导Cas9核酸酶对特异靶向DNA进行识别和切割，造成DNA的双链或单链断裂，然后，细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复，即非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源介导的修复(Homology-directed repair, HDR)。这一技术简单高效，自问世以来已被广泛地应用于各种模式生物建立遗传修饰的模型。

2013年，李劲松研究组通过将CRISPR-Cas9系统直接注入携带遗传缺陷的受精卵胚胎中治愈了小鼠的白内障遗传疾病(Wu et al; Cell Stem Cell, 2013, 13:659),首次证明CRISPR-Cas9技术能够高效地用于遗传疾病的治疗。而这种通过直接胚胎注射的方法存在两个问题：一是新生小鼠被治愈的机率较低，约为30%;二是存有少量实验脱靶现象。

在此基础上，为更好地解决这些问题，研究人员从白内障小鼠的睾丸中获取了携带纯和遗传突变的精原干细胞。精原干细胞是一类可以在体外长期培养、能够维持稳定的表观遗传特性、并能在受体小鼠中产生功能配子的生殖干细胞。研究人员将CRISPR-Cas9转入精原干细胞系中，通过单细胞扩增的方式建立了一系列来自单个精原干细胞的细胞系。随后，研究人员对这些细胞系进行了深入分析，选择满足以下三个条件的细胞系进行移植实验：1)通过基因型分析确定两个突变位点均已修复;2)通过预测脱靶位点测序或者全基因组测序确定不存在脱靶问题;3)通过特定印记基因甲基化鉴定或者全基因组甲基化测序，确定修复的精原干细胞维持正常的表观遗传特性。最后，将这些“优质”细胞移植到去除了生殖细胞的受体小鼠睾丸内后，研究人员获得了100%完全健康的小鼠。

CRISPR-Cas9技术介导的生殖细胞遗传修复为人类基因治疗提供了一条新的思路。今后的研究需要验证这一技术路线在人类的生殖细胞中实施的可行性。

吴宇轩、周海、范小英、张英和张满为本文的共同第一作者，参与该研究的合作单位和人员包括上海市计划生育研究所施惠娟研究员、西华大学伍春莲教授等，工作得到了国家科技部、国家基金委、中国科学院(干细胞先导专项)以及上海市科委经费的支持。

精原干细胞介导的基因治疗模式图