由于目的基因随机整合到基因组，因此首代转基因小鼠将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不同的首代转基因小鼠中也不同。由于这些原因，每一个首代转基因小鼠需要作为一个独立的谱系对待并且与其它首代转基因小鼠分开来进行繁殖。 每个首代转基因小鼠的子代都需要进行转基因遗传和表达的检测。由于不同的整合位点和拷贝数，每一个首代转基因小鼠可以有不同的表达水平。

一般可采用经典育种与PCR 相结合的方法对转基因小鼠纯合子进行筛选。将用于建系的原代(F0) 转基因小鼠与野生型小鼠配种繁殖产生的后代(不同窝的仔鼠分别统计) 为F1。F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生的后代为F2。在F2 中选择数对阳性鼠同胞交配产生的后代为F3。根据各窝鼠的整合率及PCR-Southern 的信号，选出假定纯合小鼠。将假定的纯合子小鼠与野生型小鼠配种产生F4，根据后代整合率，对假定的纯合子转基因小鼠作出验证。可继续传代以求建立稳定的转基因小鼠品系。

通常情况下，制作转基因小鼠，并经过筛选鉴定之后，可以得到纯合子的转基因小鼠，而要对某种转基因小鼠保种，则可以直接用纯合子来保存育种。

但是也有例外：如果目的基因有毒性、致畸或胚胎致死性，则有可能无法得到首代转基因小鼠；或者由于纯合后基因的毒性增加，导致后代健康状况差，丧失生育能力或存活期短等问题，此种情况，纯合子转基因小鼠不适合用作种系保存，我们会用半合子小鼠代替，半合子能减轻这种基因效应，但也因此而带来了筛选工作，这样每次繁殖都需要经过烦杂的筛选。