( 五 ) 精子获能检测

精子获能后将发生一系列明显的变化,主要表现为代谢活动显著增强,氧摄入量增加2～4 倍,运动速度加快,头部膨大,极易发生顶体反应。为判断精子获能与否,通常采用以下几种检测方法。

1. 精子形态及运动方式的观察

获能的精子可在倒置显微镜下观察到其头部膨大,活力增强,出现超活化的运动现象。与未获能处理的精子做前后比较,即可初步判定精子是否获能。

2. 顶体反应的检测

如要进一步确切判定精子是否获能,则可通过诱发其顶体反应,然后检测其顶体的完整曾得出定论。具体做法是将经获能处理的精子与100µg/m1的溶血卵磷脂孵育15min,然后通过下列方法检查顶体的完整情况 :

双重染色法 : 精子经获能处理后,加入等量1%多聚甲醛PBS 固定15min,而后离心0.5min(9000 -14000g)。去掉上清液后,加入1ml等渗的 NaCl溶液,再离心 0.5min 去掉上清液。取 25µl精液与 25 µl 2.9% 柠檬酸钠溶液混匀,然后加入5Oml 染色液(1.7份95%,1.4 份1%Fast green FCF，0.7份 1%Eosin B)染色 1.5min。取 lOµl经染色的精液涂片、干燥,然后加盖盖玻片,在放大400～500倍的明视野显微镜下观察。如在头部有厚的蓝绿区，表明明顶体完整。如仅见粉红色,表明顶体脱落,已发生顶体反应,说明精子已经获能。该法的优点是无需昂贵的设备,简单易行;缺点是易发生误判。

透射电镜观察:获能的精子经溶血卵磷脂诱发顶体反应后,按照电镜技术的固定、包埋和切片,然后进行顶体的完整性观察。若发现精子头部质膜与顶体外膜泡状化,或仅残存顶体内膜,便可判断精子已发生顶体反应。此法的成本高,制片繁琐,可操作性不强。