1.卵子的收集和处理

按常规方法收集卵母细胞,即用PMSG和HCG处理,将卵母细胞一卵丘复合体用 3%柠檬酸钠低渗振荡处理,再以0.1%透明质酸酶除去颗粒细胞后移入培养小滴中,以备用于显微镜受精。

2. 精子的制备

将已经处死小鼠输精管中的精液移入1ml 的 T6 液小管中,在培养箱中经过2h 的获能(卵胞质内精子注射法可以不用获能处理)处理。把处理好的精子放入覆盖有石蜡油的小液滴里。卵胞质内精子注射法用的精子按 1 份精子悬液加到 3～4 份T6液中,内含 10%PVP,予以制动处理 , 使精子容易吸进注射管中。

3. 精子注射

在培养皿中制备数个5Oµl的小滴,正中一滴为精子PVP悬液。周围数滴为 HEPES-CZB液,每滴移入 2-5 个卵母细胞。在显微操作仪下,用注射管自尾部将精子吸入14 个。用固 定吸管吸住卵,使极体在液滴"12"点钟或"6"点钟的位置 c 注射吸管自"3" 点钟位置刺入一个或多个精子 , 其后轻微撤出注射管,并释放卵母细胞。

4. 注射卵的体外培养与移植

将注射后的卵母细胞经过 HEPES-CZ液洗3次后移入CZB 培养液滴中 (5～10 枚卵/μ),在二氧化碳培养箱中培养 6～8h 后,如果卵裂即可移植。也可继续培养 3-4d,待发育到囊胚,再进行移植。