( 二 ) 受体卵母细胞的准备

在哺乳动物的核移植研究中,用作核受体的主要有去核受精卵(原核胚 ) 及去核MⅡ成熟母细胞两种。虽然采用去核受精卵的细胞质作为核受体己得到了克隆动物,但供体胚胎不能超过2细胞阶段,否则其重构胚无法正常发育。成熟的卵母细胞被广泛用作核移植的受体细胞。最初,受体卵母细胞大都采用超排体内成熟的卵母细胞。随着卵母细胞体外成熟培养的完善,现在人们都采用体外成熟的卵母细胞作为受体细胞。此外,冷冻保存的卵母细胞指核移植受体细胞也是今后的发展方向。

受体卵母细胞在核移植前需进行去核。如果不去核或去核不完全的话,将会因重组胚染 体的非整倍性和多倍体而导致发育受阻和胚胎早期死亡。因此,去核方法极为重要,目前常用的去核方法有以下几种。

1. 盲吸法

由于第一极体刚排出或排出后不久,染色体就在极体的附近,因此用显微去核针吸取极体的部分细胞质便可去掉细胞核。通常,采用盲吸法去核的时间应尽可能选择在刚排出第一极体时。

2."半卵法"

将卵母细胞切为两半,去掉含有极体的一半,然后用不含极体的一半进行核移植。虽然这种方法的去核率可保证100%,但由于细胞质减半,会影响胚胎的正常发育,因此有人通过将两枚去核的半卵与供体细胞融合,并取得了良好的效果。2001年,Booth 等将两枚半卵与颗粒细胞融合,取得了90%的融合率和37%的囊胚发育率。

3. 荧光引导去核法

先用 Hoechst33342(2～8µg/ml)对卵母细胞染色10～15min,然后在荧光显微镜下确定核的位置,去核后再观察吸去的细胞质或去核后的卵母细胞是否含有细胞核,以保证去核成功率。