Polejaeva 等人建立的猪体细胞核移植技术程序如图 5-4-2所示 :

( 一 ) 修改的 NCSU-23 培养液
NCSU-23 培养液是一种不含 NaHC03 的磷酸盐缓冲液。生理 pH 值的磷酸盐缓冲液是用 3:1 克分子比例的二元磷酸基团阴离子和一元磷酸基团阴离子组成的。这些离子交换导致了Na+、K+浓度的不断变化,使 NaC1、KCl 的浓度得以调节,维持摩尔渗透压浓度和 Na+/K+比。
( 二 ) 供体母猪的超排及卵母细胞、受精卵的收集
给体重 125～145kg 的杂交青年母猪在饲料中均匀拌入18～20mg 的 Regu-Mat 进行同步发情。根据母猪所处的性周期时期饲喂5～14d,在 Regu-Mate 处理的最后1d肌肉注射 250µgEstrumate(Bayer)。在最后1 次饲喂 Regu-Mate 后 15～17h,肌肉注射1500IU 的PMSG,诱导母猪超排。注射PMSG 82h后,再肌肉注射 1000IU 的 HCG。注射HCG 46～54h 后,用含有4g/L胎牛血清并预热的Dulbecco's 磷酸盐缓冲液逆向冲洗输卵管,收集卵母细胞。在注射 HCG 后 24～36h 进行人工授精或自然交配,并收集受精卵。在注射HCG后 52～54h 后,用含4g/L 胎牛血清的 PBS 冲卵。
( 三 ) 猪颗粒细胞的分离与培养
注射 HCG 28～51h 后,将超排杂交母猪体内直径 2～8mm 卵泡的卵泡液吸出,离心1Omin,收集的颗粒细胞悬孵于 DMEM(含10%的胎牛血清、0.01mM 非必需氨基酸、2ng/ml碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF),6 µl/ml 的庆大霉素)中,继续培养生长几天之后冷冻保存。在进行核移植前,在每个内含 0.1mM 非必需氨基酸、2ng/ml 的 bFGIF和10% 牛血清的DMEM 液的35mm 培养皿中放置 (1～5)×104 个颗粒细胞,在 37℃混合培养至完全汇合。这些细胞在含0.59%胎牛血清的 DMEM 中进行48～72h 的血清饥饿培养。后用膜蛋白酶消化并收集,在用于核供体之前放入修改的 NCSU-23 磷酸盐培养液中38.5 ℃悬浮贮存20～120min。
( 四 ) 卵母细胞的激活
将卵母细胞置于激活介质中,用 1.OkV/cm 的直流电剌激,每隔 5s电剌激60µs,共电击2次。激活介质是含有0.1mM  MgS04 、0.05mM CaC12 及 0.3M 的 D-山梨糖醇溶液。
( 五 ) 第 1 次核移植胚胎的重构
收集到的卵母细胞用含有4g/L BSA 的 PBS(38 ℃)洗几遍,然后移入 38 ℃不含钙的 NCSU-23 磷酸缓冲液中带回实验室。为了去核,用直径 18mm 的玻璃针管吸去处于第一极体下的少量胞质,吸出的细胞核暴露在紫外光下以确定中期板的存在。将卵母细胞培养在38℃，含有 5pg/ml 的细胞松弛素B 和 7.5µg/ml Hoechet-33342 的去钙磷酸缓冲液NCSU-23中2Omin。 每个颗粒细胞放于每个去核的卵母细胞的透明带下。将这个嵌合物移入融合装置中，融合介质为 700µl含 0.3M 的甘露醇 ,0.1mM MgS04 和 0.1mM CaC12 的去离子水 , 摩尔渗透压浓度为 280mosm。用 5V 的交流电击 5min,随后用1.5kV/cM 的直流电击 2 次 ( 每次60µs"), 融合并活化细胞。使用的仪器是 ECM2001 的电剌激细胞操纵仪 (BTX Inc San-Diego)。然后,嵌合物用二元碳酸盐溶液NCSU-23 洗几遍,在含 5%C02 的 38.5℃湿性气体环境中培养0.5～lh, 用倒置显微镜将融合的嵌合物放大 300 倍观察。融合的细胞再进行一次活化剌激 ,用1.2kV/cM 的直流连续电击 2 次,每次6Oµs;处理后在 NSCU-23 培养液中培养过夜。
( 六 ) 第 2 次移植胚胎的重构
将受精卵在 Biofuge-13 离心机中14 900g离心 15min;然后置 38 ℃含 5.0µg/ml 细胞松弛素B的磷酸盐缓冲液 NCSU-23 中培养 2Omin。含有2个原核的受精卵,用 25～35µm的玻璃细管吸出与膜相连的包含 2 个原核的核体,从而去掉细胞核(如已排出第 2 极体,也一并取出)。包含假原核的核体,从第 1 次核移植那天开始准备,其方法与合子去核相同,只是采用3O～45µm 的去核玻璃针管。单个的核体放入单个去核受精卵的卵周隙内。用5V的交流电击5s,再用 1.2kV/cM 的直流电击2次,每次60µs,进行融合嵌合物用38℃的 NSCU-23的缓冲液洗几遍并在 5%CO2的湿气环境中培养30～60min,再迅速移入同步发情的受体母猪的输卵管中。 .
( 七 ) 受体母猪的处理
共同使用 PMSG 和 HCG可以维持妊娠。在发情周期的第 10 天肌肉注射 10000IU 的PMSG,3～3.5d 后,即发情周期的第13天肌肉注射 HCG 。