( 一 ) 饲养层培养法
(1)ES 细胞种植到用丝裂霉素处理或γ射线照射后制成的饲养单层上,换上 ES 细胞培养液。
(2)37℃、5%C02、100% 湿度培养箱培养,每天观察,及时更换培养液,每2～3d以 1:3至 1:6 的比例消化传代。
(3) 消化前,弃培养液;PBS洗涤 1 次后,加入胰蛋白酶-EDTA消化液,以能覆盖细胞表面为度,作用 3Os;弃消化液,让残余消化液继续作用,轻敲培养皿(瓶)底部,细胞层出现裂缝,细胞纷纷脱落时,加入 ES 细胞培养液,轻轻吹打至成单细胞悬液。
(4) 正常的 ES 细胞集落应该是:边缘清楚,表面光滑,结构致密,隆起生长,碱性磷酸酶检查呈阳性。若饲养条件不适 ES 细胞易于分化,集落变得扁平,边缘不清楚,表面粗糙,见有较大内胚层样细胞结构,碱性磷酸酶检查呈阴性。
( 二 ) 无饲养层培养法
(1)UF 的使用于 ES 细胞培养液中加入LIF, 浓度 100OU/ml 即可在无饲养层下培养ES细胞。
(2)Buffalo 大鼠肝细胞 (BRL) 条件培养基 (BRL-CM) 的使用 BRL 是一种细胞株,能分泌LIF,故收集其上清可用于 ES 细胞的培养。方法是:以2×105个/ml 浓度种植细胞,培养 72h,收集上清液,使用的培养液为不加 LIF 的 ES 细胞培养液。培养上清使用前过滤弃细胞碎片。使用时,6～7份培养上清加3～4份不加LIF 的 ES 细胞培养液,再加入8-10% 胎牛血清,组合成 BRL-CM。使用 BRL-CM 培养 ES 细胞不加饲养层,同LIF一样可保持 ES 细胞未分化性和多潜能性。
(3) 大鼠心肌条件培养基 (RH-CM) 的使用 2-3 周龄大鼠的心肌细胞培养上清也有 B 也培养上清相类似的作用。方法是:将 2-3 周龄大鼠的心肌制成单层细胞,以 1:2 传代,收集 5 代内的培养上清。所用的培养液为不加 LIF 的 ES 细胞培养液。培养上清使用前过滤弃细胞碎片,使用时,6 份培养上清加 3 份不加 LIF 的 ES 细胞培养液,再加 1 份胎牛血清,组合成RH-CM。
(4) 元饲养层培养 ES 细胞,呈岛屿状生长,克隆的特征性形态更清楚。