( 一 )3.5d 怀孕鼠的准备及 3.5d 胚胎采集
(1) 性成熟前期母鼠 ( 昆明鼠大约 4 周左右,24～26g 最好)于 11～13h 或 16-18h 腹腔注射孕马血清 (PMSG),5～1OIU/鼠。
(2)46～48h 腹腔注射绒毛膜促性腺激素 (HCG),5～1OU/鼠,同时以 1:1 比例与公鼠合笼。
(3) 第 2 天上午观察雌小鼠阴道栓,见栓者当天为怀孕0.5d,见栓第 4 天为怀孕 3.5d。
(4) 怀孕 3.5d 母鼠断颈处死,无菌条件下打开腹腔,暴露子宫。
(5) 镊住近子宫颈端,剪断,分离子宫系膜,并于输卵管端剪断子宫角。
(6) 小鼠为双侧子宫,分离后的子宫用无菌滤纸吸干血迹后置于无菌平皿内(直径35mm)。
(7)lml灭菌注射器吸入冲卵液,从子宫角端进针,针头要保证进入子宫腔内,将冲卵液快速推入子宫腔(0.2～0.5ml/侧子宫),胚胎连同冲卵液从子宫颈端排出。注意用平皿接好排出的冲卵液。
(8) 将盛有胚胎冲卵液的平皿置于显微镜下 (50～100 倍 ),仔细采集胚胎。3.5d胚胎一般处于囊胚期,但也有可能处于桑葚胚期,均可使用。
( 二 ) 胚胎培养
(1) 胚胎培养液在直径 35m 平皿内做成小滴,每个直径 35mm 平皿可做成 4 个小滴,上覆盖石蜡油。
(2) 收集的 3.5d 胚胎置人培养小滴内,37 ℃、5%C02 、100% 湿度培养箱培养。
(3) 每天观察,更换培养液 1～2 次/d 。
(4) 待胚胎发育为囊胚腔充分扩展或突破透明带时移植到 MEFs 或 STO 饲养单层(用直径 35mm 培养皿准备,上覆盖透明液状石蜡)上继续培养,此时换上 DMEM(高糖)培养液(+ 10% 新生牛血清 +10% 胎牛血清 + 双抗 )。
(5)1～2d 后,胚胎贴附在饲养单层上,进一步,滋养层细胞扩展开并形成薄薄一层,将饲养层细胞推开,内细胞团位于中央向上隆起生长,边缘界限清晰,表面光滑,结构致密,3～5d内细胞团块增大,即可作为内细胞团块分离和早期细胞培养。此期间要隔天换部分培养液。
( 三 )ES 内细胞团细胞培养分离
(1) 细吸管的准备:毛细吸管一端在火焰上拉细,用砂轮将末端切断 , 准备末端比内细胞团稍大和稍小两种。
(2) 内细胞团生长良好的培养皿置于显微镜下(50～100 倍),用末端比内细胞团稍大的细吸管挑起内细胞团,收集到覆盖有透明液状石蜡的培养小滴内(用胚胎培养时相同的培养液)。  (3) 将内细胞团块收集齐后,一同置于覆盖有透明液状石蜡的膜蛋白酶 -EDTA 消化被小滴内,用消化液洗涤 1 次,弃除残余培养液,加入新的消化液,37 ℃作用3～4min。
(4) 改用末端比内细胞团稍小的毛细吸管,轻轻吹打内细胞团块,至分散成 2～4个细胞在一起的小团块。
(5) 将含有内细胞团细胞的消化小滴吸至 MEFs 或 STO 饲养单层上 (预先用丝裂霉素或γ射线处理),换上 ES 细胞培养液。 |
(6) 每天观察,2d 后,可见 ES 样细胞小集落出现,3～4d 集落进一步增大,6～7d,可按ES细胞培养方法进行消化传代。