ES 细胞保存方法一般是冷冻保存,冷冻保护液一般为培养液加10%～15%DMSO(二甲基亚砜)。冷冻过程为:室温下平衡1Omin→ 10℃冰箱 3～5h → -7 ℃冰箱过夜→第二天放入液氮中长期保存。也可以 -70 ℃冰箱中保存几个月。解冻一般在 37℃水浴中进行,解冻后一定要立即用新的培养液替换冷冻保护液 ,800～100Or/min离心 5min,弃上清,重新加培养液培养。随后转入 C02 培养箱中进行培养。
六、 ES 细胞的鉴定
ES 细胞是一种正常的胚胎性干细胞,具有正常的二倍体核型、体内外分化能力及整合到宿主内细胞团并共同发育成嵌合个体的能力,但其易分化变异,引起这些能力的减弱甚至于丧失。故 ES 细胞体外培养时间久以及内细胞团细胞一旦消化传代时,都要及时进行 ES 细胞核型的鉴定及体内外分化能力及嵌合能力的观察,以评定 ES 细胞进一步应用的价值。
( 一 ) 细胞表面标志鉴定
(1) 碱性磷酸酶染色呈强阳性。
(2) 显示高水平的端粒酶活性。
(3) 表达胚胎特异性抗原 SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60 和 TRA-1-81等。
( 二 ) 核型鉴定
参照细胞系(株)的建立和鉴定,结果显示正常的核型。
( 三 ) 体外分化能力的观察
(1)ES 细胞按常规方法消化,但不要吹打成单细胞悬液而让其保持团块状。
(2) 移置无饲养层培养瓶(皿)内,培养液中不加 LIF,胎牛血清浓度降至 10%。
(3) 按常规培养条件培养,但每天轻轻晃动培养瓶(皿)或用吸管吹打 2～3次/d,不让细胞团块贴壁和粘连在一起,必要时换部分培养液。
(4) 每天观察,一般 3d 左右,ES 细胞团块开始分层,外部一层是较大的内胚胎层样细胞,内部细胞小而紧密,为外胚层样细胞和干细胞。此时为简单类胚,培养至 5～1Od,分层增多,并逐渐出现囊腔,最终细胞团块长大成圆泡状的囊状胚。
(5) 如果细胞团贴壁也可以分化,长出如上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞等多种细胞,将这些细胞团块挑出固定,可初步了解其分化时间和能力的强弱。
(6) 不同的 ES 细胞,分化能力不同,根据其分化程度的不同,可初步了解其分化能力的强弱。
( 四 ) 体内分化能力的观察
(1)生长良好的 ES 细胞,按常规方法消化制成单细胞悬液,计算细胞总数。
(2)(2)500～10OOr/min,离心 5～10min 弃上清液。
(3) 加入少量培养液,调成高浓度细胞悬液(约1×108/ml)。
(4) 取同种小鼠,腹股沟注射 ES 细胞高浓度悬液,每只鼠约1×107 个细胞。或接种裸小鼠腹股沟皮下,1×106个细胞/鼠即可。
(5) 小鼠接种细胞后放回笼内饲养,约 2 周后腹股沟注射处出现肿块 ;4～5 周后肿块进一步增大,处死小鼠,摘除肿块。
(6) 肿块一部分固定,切片,染色,观察;另一部分消化制成单细胞悬液体外培养。继续观察,切片中可见属于各个胚层的组织分化,如各种上皮组织、神经纤维、角质化的复层扁平上皮、肌肉组织、软骨、硬骨、腺腔、神经管以及干细胞巢等,为畸胎瘤结构。体外培养的细胞见有多种细胞生长,如上皮细胞、骨髓肌细胞、神经细胞、成纤维细胞、心肌细胞以及干细胞集落等。
(7) 也可以腹腔注射,剂量同腹股沟接种。见小鼠腹部逐渐涨大,2～3 周后,处死小鼠,打开腹腔,也可见到大小不一畸胎瘤肿块,游离或粘连在肠系膜上。同样可以摘除固定、切片、染色以及体外培养,观察结果同上。
( 五 ) 嵌合能力的观察
将 ES 细胞注射到宿主囊胚腔内,其能融合到宿主囊胚的内细胞团内共同发育成个体(嵌合体)。来源不同动物品系的 ES 细胞,有不同的遗传特点,通过这些遗传特征的观察,可以确定ES细胞是否整合、分化、发育。目前,最常用的方法是对新生个体毛色的观察。
(1) 定 ES 细胞的来源及选择宿主鼠品系:大多数 ES 细胞来源于129 品系小鼠。129小鼠毛色为野灰色,应选择自化体鼠(如 BALB/c)和非野灰色。
(2) 若是来源于 C57BL/6 鼠的ES细胞,则应该选择自化体鼠(如BALB/c) 和野灰色(如129品系)鼠,产生的嵌合体应该是花色鼠,被毛是白色和野灰色或黑色相间,虹膜为野灰色或黑色。
(3) 准备为 3.5d 受体囊胚。
(4) 生长良好的 ES 细胞消化制备成单细胞悬液。
(5) 应用显微注射仪将 ES 细胞注射到受体囊胚腔,10～15个ES细胞/囊胚。
(6) 将注有 ES 细胞的囊胚注射到假孕母鼠子宫腔,让其发育并产下个体并鉴定融合情况。