哺乳动物胚胎的冷冻保存最早成功于 1972 年 ,Whittingham 等人首次发明了慢速冷刷 . 对小鼠的胚胎冷冻保存获得成功,解冻后移植产下了后代。他们使用的冷冻保护剂是DMSO人工植冰后以 0.33 ℃ /min 的速率降至 -35 ℃,然后再以 1 ℃ /min 的速率降至 -80 ℃后投入液氮中保存,整个过程约需3h。其保存的胚胎 80% 具有继续发育的能力。这种方法经过30年的发展,效果已基本稳定,目前仍然在世界范围内广泛使用。应用这种方法,兔(Whittingham,1976)、大鼠(Whittingham,1975)以及其他共 I6 种动物的胚胎保存成功、解冻移植后产下后代。1977 年,Willadsen 等人对上述方法进行了改良,发明了快速冷冻法,将冷冻降温的时间缩短1h。1985 年Rall等首次发明了玻璃化冷冻法,对小鼠 8 细胞胚胎冷冻保存取得成功。此后,玻璃化冷冻法经研究者不断改进,日趋成熟。该方法不需要慢速降温过程,胚胎在0℃以上的温度下,置于高浓度且易形成玻璃化的溶液中平衡后,直接投入液氮,使细胞内、外液皆形成玻璃化状态,胚胎不会死亡。

目前,哺乳动物胚胎的冷冻保存技术已广泛应用于生产和科研实践,各种动物的冻胚应用于国际和国内的品种资源的交流和遗传资源的保存。据统计,国际上已有 20 余个国家、近30个单位开展了小鼠冷冻胚胎库的工作。美国杰克逊实验室从 1978 年至今,己冷冻保存 500多个小鼠的品系。 

( 一 ) 慢速冷冻法

目前为止沿用的慢速冷冻法,在室温下用 PBS 等生理性溶液配制成 1.O～2.Omol/L的抗冻保护液,将胚胎置于此溶液中处理。采用的抗冻保护剂为 DMSO 、丙三醇和乙二醇等。由于细胞外部的抗冻液渗透压比较高,为保护细胞内、外渗透压的平衡,细胞内的水分向外渗出,胎开始收缩。随后抗冻保护剂渗入,同时水分向细胞内回流,胚胎体积得以恢复。平衡时间需lO～20min。其操作程序如下。

1. 植冰

将胚胎装入配置好抗冻液的 0.25ml 塑料细管中,于程序降温仪中降温。当降温至冰点稍低于冰点温度时(含有 1.5mol/L 抗冻保护液 ,约-4℃),使用浸入液氮冷却后的镊子夹住细管的棉栓部,瞬间使抗冻液产生冰晶,这种强制性使细胞外液形成冰品的操作称为诱发冰,也称作植冰(ice seeding)。若不实行植冰,在冰点下暂时没有结冰的状态下继续降温,时细胞脱水速度很慢,当细胞外液冰晶形成时,细胞内的水分脱出不完全,使得细胞内部也产生冰晶,导致胚胎死亡。

2. 冷冻

植冰后以 0.3～0.5℃/min的速度降温至-30～-35℃,在降温过程中,细胞外液冰品逐渐增加和溶液不断浓缩,为调节渗透压的平衡,细胞内的水分不断渗出并形成冰晶,使得细胞内、外液的同时浓缩。胚胎与精子相比体积较大,但相对表面积较小,在低温条件下细胞内的水分向外渗出需要一定的时间,所以缓慢降温是非常必要的。如果降温速度过快,水分来不及渗出,在细胞内部便形成冰晶,对细胞产生物理性损伤。最初的胚胎冷冻方法是连续慢速降温到 -6O～-75 ℃时投入液氮中(Whittingtham et al,1972)。随后,冷冻方法得到改进,慢速降温至-25～-35 ℃时投入液氮中冷冻保存(Willadsen,1977)。迄今,上述冷冻方法仍被广泛使用。

缓慢降温使得细胞内液高度浓缩,即使降温到液氮相同的温度,胞质内也不会有冰晶生成。另外,细胞外液的冰品之间也有部分浓缩的溶液存在,这部分溶液也不会形成冰晶。无论是何种溶液,在急速降温的情况下,溶液的黏性急剧增高,形成非结晶的固体的现象,称为玻璃状态,即玻璃(vitrification)。溶液形成玻璃化的温度(玻璃化转相温度)在-10～-130 ℃之间。若快速通过此温度域,易造成胚胎破裂。所以当样本慢速降温至-25～-35℃(或 -60～-75 ℃)时,不直接投入液氮中,而是在液氮中熏蒸数分钟,使其缓慢通过玻璃化转相温度,然后再投入液氮中,冷冻效果较好。

胚胎在溶液中保存期间,随时间的延长,其生化能力逐渐下降。但是,当细胞外液形成玻璃,即形成固态时,分子停止运动。若要进行长期保存必须在-130 ℃以下,通常使用液氮保存。液氮保存的温度为-196 ℃,液氮气中保存也能保持 -150 ℃。长期冷冻保存的情况下,胚胎解冻后其生存力不会受到影响。

( 二 ) 玻璃化冷冻法

1985 年 Rall 等人利用小鼠的胚胎为实验材料,研发了胚胎玻璃化冷冻法(vitrification)。这种方法不需要程序降温仪进进行慢速降温过程。另外,由于细胞外液不生成冰晶,几乎不产生物理性损伤,操作简单且生存率高。之后,许多研究者对此方法进行不断改良,使其正朝着实 用化方向发展(kasai,1997;加藤等,1997;kasai et aI,1999;Zhu et al,1993)。

玻璃化冷冻法所采用的抗冻保护液,投入液氮中细胞内,外液皆无冰晶生成,即称为玻璃化溶液。此溶液是以PBS为基础液,添加高浓度的抗冻保护剂配制而成。当抗冻保护剂的浓度达到 50%(V/V),或 8.Omol/L 以上时,选择化学毒性较低的物质是非常必要的。到目前为止,研制出来了多种改良的玻璃化溶液,抗冻保护剂的组合也多种多样。最近大多数研究采用乙二醇为主体抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液,浓度约为7.5mol/L(kasai,-1990)。乙二醇且有化学毒性较低、渗透速度较快等特点,对胚胎短时间处理即可达到细胞内外抗冻保护剂平衡,避免其对胚胎的化学毒性作用。

在玻璃化溶液中,添加渗透性抗冻保护剂的同时,有必要添加聚煎糖、葡萄糖聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙二醇、胎牛血清和牛血清白蛋白等高分子物质以及庶糖和海藻糖等非渗透性糖类物质(kasai,1997)。这些物质化学毒性较低,高分子物质对溶液形成玻璃化具有重要作用。添加非渗透性物质也可以降低抗冻保护剂的浓度,因此起到降低玻璃化溶液的毒性作用。另外,荒糖类物质的渗透压作用使细胞发生收缩,从而限制渗透性抗冻保护剂过量地渗入细胞内,间接地起到降低化学毒性的效果。

kasai等(1990) 发明的胚胎一步法玻璃化冷冻保存(如图5-6-1A)。 该方法利用乙二醇为主体抗冻保护剂,添加高分子聚庶糖和渗透压较高的庶糖,配制约 7.5mol/L 浓度的玻璃化溶液,在室温(20℃)条件下,将胚胎直接装人含有玻璃化溶液的塑料细管中,经2min平衡后投入液氮,小鼠桑葚胚冷冻解冻后的发育率达98%,家兔桑葚胚冷冻解冻后 100% 发育到囊胚。

  Zhu等(1993,1994,2000)研发的二步法玻璃化冷冻(如图 5-6-lB), 分别采用乙二醇或丙三醇以及乙二醇和 DMSO 为主体抗冻保护剂,配制成 EFS、GFS、EDT 玻璃化溶液,在到(20～25 ℃)条件下,先将胚胎在10%乙二醇(或丙三醇,或10%乙二醇+10%DMSO) 溶被中预处理 5min, 然后再移入含有上述玻璃化溶液的细管中,平衡 30s 后将细管封口 , 投人液集中冷冻保存。小鼠、家兔体内生产的囊胚经冷冻解冻后的继续发育率达 92%～98%。

二步法冷冻处理的优点在于,具有腔体的囊胚,渗透性抗冻保护剂向细胞内渗透需要较长时间,如果在高浓度的玻璃化溶液中直接平衡 , 随着时间的延长,化学毒性对胚胎的影响加大。所以首先用低浓度抗冻保护剂预处理胚胎,使抗冻保护剂渗透到细胞内部,然后再移入高浓度玻璃化溶液中平衡,短时间内细胞高度脱水和抗冻保护剂充分渗透后冷冻保存。这种做法既能使抗冻保护剂向细胞内部充分渗透,又能避免高浓度玻璃化溶液的化学毒性的损伤,同时又能很好地形成玻璃化状态 , 提高冷冻、解冻后的胚胎存活率。

( 三 ) 解冻方法

慢速冷冻和玻璃化冷冻法的解冻方法有所不同。

1. 慢速冷冻法的解冻方法

慢速冷冻法保存的细管,胚胎由液氮中取出并在空气中停留10～15s 后,浸入室温水制37℃水浴中解冻。空气中停留是为了慢速通过胚胎易产生破裂的温度域 (-110～-130℃。由于此方法受冰晶生成的影响,彻底防止细胞破裂的产生有一定的困难。

慢速降温不论是 -25～-35 ℃或 -60℃以下冷冻保存的样本,其细胞内液的浓缩程度均不充分,在解冻升温过程中有冰晶形成现象,这种现象称为脱玻璃化(devitrification)。脱玻璃化的产生对细胞具有致命性的打击。产生脱玻璃化的温度域为 -80～-50 ℃,升温速度越慢越容易产生此种现象。为避免脱玻璃化现象的产生,解冻时必须快速通过这个温度区域。所以细管在空气中停留后,应迅速浸入水浴中升温。

解冻后将细管中的内容物冲出,用 PBS 或其他等渗液稀释 0.5mol/L 庶糖液脱出细胞内部的抗冻保护剂,然后将胚胎移入等渗生理溶液中洗净备用。

回收的胚胎需在显微镜下操作,胚胎需要重新装入一支细管中移植给受体动物。这种操 作有些繁琐,操作过程中容易丢失胚胎。若像冷冻精液一样,解冻后胚胎不出细管直接移植,则在生产中会更实用。所以有研究者在细管内将冷冻保存液和稀释液用空气层隔开,解冻后用力甩动 , 两液混合后进行移植(Leibo,1983),近年来这种方法在生产中得到部分应用(Voelkel et al,1992)。上述方法解冻后不经稀释,抗冻保护剂的脱出是在动物子宫中进行。为此应选用对细胞膜通透性强、化学毒性低的抗冻保护为宜。试验证明,乙二醇要比丙三醇等 其他种类的抗冻保护剂效果好。

另外,慢速冷冻法使用的抗冻保护剂的物质的量浓度较低,对胚胎的化学毒性影响较小，所以解冻后的胚胎在细管中放置数十分钟,对其影响不大。