1. 玻璃化冷冻 ( 囊胚或晚期桑葚胚 )

(1) 胚胎采集   按本章第二节所述的方法采集小鼠早期囊胚或晚期桑葚胚,再用DPBS被清洗3次后备用。

(2) 液体的配制

DPBS 液:DPBS 粉剂加定量双蒸水。

平衡液 EG10: 乙二醇与 DPBS 液按体积比 1:9 混合。

冷冻液 EFS40( 玻璃化冷冻液 ):30% 的聚蔗糖 +0.5mol 蔗糖经DPBS 液溶解后与乙二醇按体积比 6:4 混合。

解冻液 : 用 DPBS 液配制的 0.5mol/L 蔗糖液。

以上所有液体配制后均经 0.20µm 醋酸纤维素膜无菌过滤。

培养液 M16。

(3) 冷冻程序   用 DPBS 液清洗 3 次小鼠胚胎后移人 EG10 乎衡液微滴中,每个50µl的微滴中移入20枚左右的胚胎。平衡1Omin后,将胚胎吸出,移人事先装有150µl冷冻液的细胞冷冻管中。盖紧盖后将细胞冷冻管放置 -20℃冷冻室中10min, 然后置液氮面上 5min, 最后投入液氮中冷冻。

(4) 解冻   将细胞冷冻管从液氮中取出,放入 25 ℃的水浴中,3Os 后拧开管盖,加入400µl解冻液,摇匀后倒入培养皿中,然后再向细胞管中加入 200µl 解冻液,轻摇后倒入培养皿中,迅速将胚胎吸出,移入新鲜的解冻液中,5min后拣出胚胎在DPBS液中清洗6～8 遍,待用。

2. 慢速冷冻 (2-8 细胞期胚 )

(1) 胚胎采集   按本章第二节所述的方法采集小鼠 2～8 细胞期胚胎,用 HEPES-HTF液洗涤数次,移入盛有含 10% 血清替代品(SSS)(Irvine Scientific)HIF液的四孔培养皿中,加盖矿物油(Sigma USA),于37℃,5%C02培养箱中培养。

(2) 胚胎冷冻过程   采用丙二醇结合蔗糖作为冷冻保护剂对胚胎进行冷冻保存。采用慢速冷冻的方法进行胚胎冷冻。将胚胎放入磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗数次;移入含1.5mol丙二醇的PBS液,平衡lOmin;转入含1.5mol丙二醇、0.1mol庶糖 PBS 液,并将胚胎装入冷冻管中，每一冷冻管中装 20~30 个胚胎,放入程序冷冻仪中进行冷冻。从室温(25 ℃左右 ) 以-1℃/min 降温到 -6 ℃;浸润 1min,植冰,再保温 9min;以-0.3 ℃/min 降温到 -32 ℃;-0.2 ℃/min降温到 -36 ℃；-1℃/min 到 -75 ℃;将冷冻管直接放入液氮中冷冻保存。

(3) 解冻  解冻时,冷冻管在室温下停留40s,然后放入30℃水浴4Os。随后,胚胎放入冻液(1.Omol 丙二醇,0.2mol 蔗糖 PBS 液)5min,胚胎用预先在37℃,5%CO2平衡好的 HTF 洗涤数次。胚胎的冷冻和解冻试剂均含有 20%FBS。在倒置显微镜下观察冷冻胚胎的活率。