动物转基因的主要方法-原核注射法
借助于光学显微镜和显微操作仪,将外源 DNA 直接注入动物原核期胚胎的一个或两个原核内来制作转基因动物的方法,是 Gordon 等人首先发明的(Gordon et al.1980)。后来经过 Brinster 等人(1985) 的改进和完善,成为一种很可靠的动物转基因方法,一直沿用到今天。该方法至少涉及以下 4 个主要步骤。
1. 外源基因表达载体的构建和用于注射 DNA 溶液的准备
线性 DNA 片段比环状 DNA 整合效率要高,因此在显微注射前需将表达质粒线性化。纯化的DNA溶于低离子强度的注射缓冲液 (1Ommol/ Tris ,pH7.4,含 0.1~0.3mmol/L EDTA),浓度在 1.0~3.Ong/µl之间。
2. 准备供注射的胚胎并制定显现原核的技术方案
有些动物的受精卵(如小鼠)在 DIC 系统的显微镜下,只要掌握好冲卵的时间,即可清楚地看见两个原核;而有些动物的受精卵(如猪)则看不到原核,这就必须有一种技术使原核显现出来。WAll等人对猪受精卵进行离心处理,使卵黄颗粒沉降到卵的一侧,便可将原核显现出来(Wall et al,1985)。
3. 实施显微注射
实施显微注射,注射胚胎的体外培养,移植到受体输卵管或子宫角处。
4. 对出生的幼仔进行基因整合和表达的检测
每种动物的生理特点不同,其操作的具体方法会有差别。
逆转录病毒感染法
逆转录病毒是一种广泛感染动物和人类的RNA 病毒,当它的基因组 RNA 侵入动物细胞后,就被转录成 DNA。被转录成的DNA 分子在它自身编码并由宿主细胞所产生的整合酶的作用下,插入宿主的基因组。将外源目的基因重组到逆转录病毒 RNA 上,制成高滴度的病毒 颗粒,再人为感染受体动物的早期胚胎,即可得到转基因动物。1987 年 Salter 等用鸡白血病毒 作载体生产出有外源基因整合的鸡;1995 年 Biery 等用劳氏肉瘤病毒为载体生产出有外源基 因整合的牛;1998 年 Bremel领导的研究组,将逆转录病毒载体注射到中期Ⅱ卵母细胞的卵周隙中,生产出高比例的转基因动物。Cabot 等(2001)利用携带GFP基因的复制缺陷型 MoMLV作载体转染体外成熟的猪卵母细胞后,进行体外受精,获得了表达的转基因猪。用逆转录病毒 作为载体构建转基因动物,其优点是感染率高、宿主范围广、外源基因为单拷贝整合、使用方便;其不足之处是具有安全上的隐患,外源基因受到逆转录病毒的限制,不可能将很大片段的DNA导人受体的基因组。最近,湖北省动物胚胎工程及分子育种重点实验室,利用猪内源性 递转录病毒做载体,使外源基因在细胞水平上得到了高效表达。利用动物内源性逆转录病毒 做载体制备转基因动物,将会克服安全上的隐患,同时由于内源性逆转录病毒基因整合的热点效应,有望实现外源基因的定点整合。
图5-7-2说明了逆转录病毒感染法制备转基因动物的基本技术程序。