第一例报道用精子介导法获得转基因动物的是 Lavitram 等人(Lavitrano et al.1989),他们将外源基因与小鼠的精子共孵育,获得高达 30% 的转基因小鼠。这之后不久,Gandolfi 和Lavitrano 等人又报道用同样的方法获得了转基因猪。他们将新鲜的猪精液离心洗涤去精清,然后与 CAT 基因共培养,再手术输入母猪的子宫角,出生的后代中21% 整合了外源基因。这种方法立即引起各国同行的广泛关注。由于原核注射法需要昂贵的设备、高难度的操作和较大的耗费,而精子介导法则使转基因动物技术变得格外简便和廉价。

然而之后的几年有些实 验室却未能重复出上述的结果,由此引发了对这一方法可信性的科学争议。问题的关键在于,精子在与外源 DNA 共孵育情况下,能否互相结合,或者说精子有无携带外源 DNA 的能力。到20 世纪 90 年代中期,世界上许多实验室的研究结果都证实了精子结合 DNA 的能力在各种动物中普遍存在。我国陈永福等人 (1990) 通过电镜观察,精子与 DNA 共育后,外源 DNA 确实进入了精子内部,当精子出现顶体反应后 , 进入的几率加大。Cheng Teng kuei等人(1995)也证实,已获能的猪精子与 DNA 共培养 (37℃ ,6Omin)后,有 40.8%～79.8% 的精子与 DNA 结合由 经过近20年的研究,人们已不再争议这种转基因方法的可靠性。迄今为止,已有 12 种动物通过精子介导的方法获得了转基因后代,其中包括小鼠、兔、猪、牛、鸡等。对精子介导的转基因体系也进行了诸多的改进,出现了许多新的方法。归纳起来,有以下两大类:

1. 体外转染

将采集的精子在体外处理,使之与 DNA 相结合,然后再采用人工授精、输卵管输精、体外受精或胞质内精子注射的方法获得转基因动物。体外转染又可分为如下几种方式。

(1) 外源精子与 DNA 直接孵育    Lavitrano 等人利用精子介导法获得第一批转基因小院就是采用的这种方式。

(2) 脂质体包埋法    脂质体是一种与细胞膜成份类似的脂类物质,其表面带有阳离子,能与带负电的 DNA 相互作用,形成脂质体/DNA 复合物。复合物通过静电作用被细胞吸附,进而由细胞融合或细胞吞噬作用进入细胞内,并释放出 DNA 分子。鉴于脂质体以上的特性,Rotmann等 (1992)先用脂质体包埋外源DNA,再与兔精子混合培养。形成的脂质体/DNA复合物比较容易和精子质膜融合,进入细胞内部;同时经脂质体包埋的外源 DNA 还可防止胞内核酸酶的降解,保持稳定性。用转染后的兔精子进行人工授精,后代的阳性率高达 63%。由于这种方法转染效率高,对精子的毒害作用小,成为目前常用的方法之一。

(3) 电穿孔导人法    该方法是利用高压电场使细胞膜通透性发生暂时性的可逆性变化,从而使外源 DNA 比较容易地进入细胞内的一种物理方法。研究证实,电击能提高精子对外源 DNA 的摄取量,但同时也发现经电击的精子受精率有所下降。所以这种方法目前还并不 常用。

(4) 胞质内精子注射法 (ICSI)    该方法是精子与外源 DNA 共孵育后,将单个精子(或头部)显微注射到卵母细胞中,从而获得整合有外源 DNA 的受精卵。Perry(1999) 最早利用 ICSI 法获得小鼠胚胎的阳性率在 64%～94%,有 17%～21%的后代表达了外源基因。

2. 体内转染

将外源 DNA 直接注射到动物的输精管或曲细精管内,使其在动物的体内与外源 DNA 相结合,从而获得转基因动物。

(1) 输精管注射法   注射到动物输精管的外源 DNA 首先在整个输精管内扩散,然后与精子接触,进而转染进精子内,再通过配种或人工授精的方式,获得转基因动物。尽管有人对这种方法的可行性提出异议,其理由是附辜分泌物及精清中的 IF-1 因子能抑制精子与外源 DNA 的结合,但Hugue等 (1998)的研究否定了上述的说法,并且通过这种方法得到了 4 只 GFP 阳性的转基因小鼠。后来也有些人通过这种方法获得了转基因猪和山羊。这种方法的局限性在于,由于转染的精子处在附辜后,且已失去增殖能力,一次处理只能产生一批转染的精子。

(2) 曲细精管注射法   曲细精管是精子发生的场所,雄性生殖细胞在成熟前的所有过程是在曲细精管内完成的。人们设想,将外源 DNA 注射到曲细精管内,转染各发生阶段的精子细胞,再通过自然交配或人工授精即可得到转基因动物。 Kim 等人(1997)将脂质仲细菌LacZ基因复合物注入小鼠和猪的曲细精管内,检测的结果表明,分别有8%～14.8% 和 15.3%～25.1% 的生殖细胞表达LacZ 基因。至今已有一些研究者用这种方法获得转基因动物。

综合精子介导的各种方法,形成的技术程序如图 5-7-3所示。

除上述三种方法,还有胚胎干细胞法、体细胞核移植法、人工染色体法、转线粒体法等。

胚胎干细胞法本文将在"基因敲除"中加以详细介绍;体细胞核移植法目前还主要用于大动物的转基因或基因敲除;人工染色体法和转线粒体法目前还处于实验研究阶段。对于实验动物的转基因目前效果比较稳定、应用比较普遍的还是原核注射法。因此本文将以原核注射法介绍单个物种的转基因动物制作过程。