图 5-7-4 说明了转基因小鼠的制作过程与结扎公鼠合笼

( 一 ) 供体小鼠的选择、超排与配种

供体小鼠品种、品系的选择要根据构建转基因动物的目的而定。制作动物模型,一般选择遗传背景清楚、同基因性(即品系中各个体遗传同一性程度)和同质性(各个体在所有遗传位点纯合程度)程度较高,同时具有很好的胚胎学特性,排卵数较多的品系。例如 C57BL 、副小鼠等。一般选用5～6周龄、体重 18～22g、健康、性成熟、SPF 级雌性小鼠作为供体。根据实验的规模确定供体的数量。

选好供体后,将动物饲养室的光线调节为 6 时～18 时为白天,18 时 ～6 时为晚上。尾静脉或腹腔注射 PMSG5～10IU( 通常在下午13 时 ～14 时进行 ),46～48h 以后注射 HCGj～10IU 。注射 HCG 后与正常雄性小鼠合笼 (1:1), 第 2 天清晨检栓,有阴道栓者为受精卵供体小鼠。

( 二 ) 受体鼠的选择和假孕母鼠的制备

受体小鼠一般选择与供体同一品系。但仅仅作为代孕母鼠,繁殖力强、母性好的其他品系也可以。一般选用 7～8 周龄、体重 25g 以上、健康、雌性小鼠作为受体。

制备假孕母鼠首先要获得结扎公鼠。将 6～8 周龄的公鼠麻醉,腹部手术,将两侧的输精结扎,缝合,休息 4 周以上备用。

在供体小鼠合笼的同一天,将准备做受体的雌性小鼠与结扎公鼠合笼 (1:1)。第 2 天清检查阴栓,有阴道栓者为假孕母鼠。

( 三 ) 受精卵的获取

检出有阴道栓供体小鼠的当天下午,取原核胚。将供体鼠脱颈处死,在无菌环境下剪下输卵管,置于 200µl的 M2 液滴中,在实体显微镜下刺破壶腹部,轻轻压出包被卵丘细胞的受精卵,转入含300µg/mI 透明质酸酶的 M2 液中消化。待颗粒细胞脱落,将受精卵在M2液滴中洗涤3次。这过程中检查受精卵的质量,淘汰未受精卵和其他不正常的卵。将正常卵移入M16液中,置于37℃、5%C02 培养箱中。

( 四 ) 基因注射

准备好显微操作仪。倒置显微镜应有相差系统或微分干涉差系统,左侧安装好持卵针,右侧安装好注射针,调整镜头和焦距。在凹玻片的中央滴一滴眼培养液,移入 10～20 枚受精卵,用矿物油将液滴覆盖。在显微操作仪下,用持卵针吸住受精卵,将含有 DNA 的注射针刺入受精卵的雄原核,注入 DNA 溶液 (2pL 左右,约含 500～600个基因拷贝)。待看到雄原核略有膨胀, 迅速退出注射针。有资料认为两个原核均注射,可以提高整合率,如此则用同样的方法注射雌原核。注射完所有的受精卵后,放入另外一个含有 8Oµl M16 培养基的液滴中,置于17℃,5%C02的培养箱培养。

( 五 ) 移植

受体假孕鼠用戊巴比妥钠按 l00ms/kg 体重的剂量,尾静脉注射麻醉或用速眠新Ⅱ号(每支稀释至 10 时,每只 0.2ml) 腹腔注射去毛,欣部剪开 0.5cm 的小口,尽量避开血管,引出输卵管及卵巢。在实体显微镜下,移卵针在M2液中吸取 20～30 枚注入DNA的受精卵,插入输卵管伞口将受精卵移入输卵管壶腹部。然后将输卵管和卵巢送回假孕小鼠的体内,缝合,消毒。全过程应尽快完成,以减少暴露状态给卵带来的不利影响。完成后,将受体鼠送入鼠笼,加强管理和观察。

移卵针吸取受精卵时要采用三段式,即气泡-卵-气泡如图 5-7-6 所示。

其中气泡 3 是为了防止移卵针尚未插入移植的部位时丢卵,气泡 2 和气泡 1 是为了保证将全部卵移入壶腹部。

( 六 ) 整合及表达检测

   受体鼠分娩后,剪取仔鼠尾尖,提 DNA。先做 PCR 检测,再将 PCR 阳性的样本做Southern杂交,确认转基因小鼠。根据表达蛋白质的种类 , 分别采用放射免疫、荧光免疫、ELASA、Weasthern blot 等技术检测转基因小鼠的表达。有的还需要进行相应功能的测试。这部分内容在"八、转基因动物的检测"中将有详细的介绍。