学术文章
条件性恐惧实验-术后认知功能障碍老年小鼠海马内组蛋白乙酰化含量的变化
【摘要】目的 观察术后认知功能障碍（ＰＯＣＤ）老年小鼠海马内组蛋白乙酰化含量的变化。方法 采用异氟醚麻醉＋腹腔探查术建立ＰＯＣＤ模型。老年雄性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠２４只，随机均分为三组：Ｏ２＋二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）组（ＯＤ组）、异氟醚麻醉＋腹腔探查术＋ＤＭＳＯ（ＩＤ组）及异氟醚麻醉＋腹腔探查术＋ＳＡＨＡ组（一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，ＩＳ组）。麻醉前２ｈ至行为学测试前２ｈ起每天腹腔注射ＳＡＨＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）或等容ＤＭＳＯ，连续注射８ｄ。术后第６天行旷场实验和场景性、条件性恐惧实验训练，第７天行场景性、条件性恐惧实验测试。行为学测试后２ｈ，取小鼠海马组织，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测Ｈ３、Ｈ４、乙酰化－Ｈ３、乙酰化－Ｈ４、脑原性神经营养因子（ＢＤＮＦ）及ｃａｓｐａｓｅ－３含量。结果 旷场实验测试中，三组探索路程和中央格停留时间差异无统计学意义。与ＯＤ组比较，ＩＤ组在场景性恐惧实验测试中的僵直反应明显减少，乙酰化－Ｈ３、乙酰化－Ｈ４、ＢＤＮＦ含量明显减少及ｃａｓｐａｓｅ－３含量明显增加（Ｐ＜０．０５）；与ＩＤ组比较，ＩＳ组僵直反应、乙酰化－Ｈ３、乙酰化－Ｈ４、ＢＤ－ＮＦ含量明显增加，ｃａｓｐａｓｅ－３含量明显减少（Ｐ＜０．０５）；三组Ｈ３、Ｈ４含量及条件性恐惧实验测试中僵直反应差异无统计学意义。结论 ＰＯＣＤ老年小鼠海马内组蛋白乙酰化含量降低；ＳＡＨＡ可提高组蛋白乙酰化水平，预防老年小鼠发生ＰＯＣＤ。
【关键词】术后认知功能障碍；老年小鼠；海马；组蛋白乙酰化
术后认知功能障碍（ＰＯＣＤ）是患者手术麻醉后出现的一种中枢神经系统并发症，老龄是其发生的独立危险因素。然而，ＰＯＣＤ的发病机制尚不清楚且缺乏有效防治措施。研究表明：阿尔兹海默病等神经退行性疾病的认知功能下降伴随组蛋白乙酰化水平降低，而组蛋白去乙酰化酶抑制剂（ＳＡ－ＨＡ）可明显增加组蛋白乙酰化水平，进而改善认知功能。本研究观察ＰＯＣＤ老年小鼠海马内组蛋白乙酰化水平的变化并探讨其可能机制。
材料与方法
动物选择与分组 老年雄性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠２４只，１６月龄，３２～４０ｇ（由南京军区总医院比较医学科提供），采用随机数字表法均分为三组：Ｏ２＋二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）组（ＯＤ组）、异氟醚麻醉＋腹腔探查术＋ＤＭＳＯ组（ＩＤ组）及异氟醚麻醉＋腹腔探查术＋ＳＡＨＡ组（ＩＳ组）。麻醉前２ｈ至行为学测试前２ｈ起每天腹腔注射ＳＡＨＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）或等容ＤＭＳＯ，连续注射８ｄ。
ＰＯＣＤ模型建立 采用异氟醚麻醉＋腹腔探查术建立ＰＯＣＤ模型。将ＩＤ组和ＩＳ组老年小鼠置于透明半封闭呼吸环路麻醉箱中，箱内装有干燥剂和二氧化碳吸附剂。放入箱内前预充１．５％异氟醚＋ １００％ Ｏ２（国 药 准 字Ｈ２００５９９１１，批 号：１７６７１５Ｕ），维持麻醉２５ｍｉｎ。待小鼠翻正放射消失后，取右侧卧位，以避免误吸，保持呼吸道通畅。麻醉箱中气体浓度由持续监测多参数麻醉气体监护仪（Ｖａｍｏｓ ＡＲＴＪ－００６２，德尔格医疗设备上海有限公司）进行连续监测。麻醉手术组小鼠在麻醉后迅速移入预充相同浓度吸入麻醉药及气体的小鼠面罩内进行麻醉及手术。手术前，剪去小鼠腹部毛发，消毒后取腹正中切口约１～１．５ｃｍ进行腹腔探查术，按以下顺序依次探查肠道、肝、脾、肾等脏器，手术时间约１０ｍｉｎ。探查结束后分别用５－０和４－０的无菌丝线缝合肌肉筋膜及皮肤。术后伤口涂抹硫链丝霉素预防感染；皮下注射温生理盐水３０ｍｌ／ｋｇ，补充术中液体丢失；保温处理。术后将小鼠放回笼中，通入１００％Ｏ２，直至意识恢复。预实验血气分析证实小鼠麻醉手术过程中无缺氧、酸中毒等并发症。ＯＤ组动物除持续吸入相同时间１００％Ｏ２外不进行任何处理。
与ＩＤ组比较，ＯＤ组和ＩＳ组僵直反应明显增加（Ｐ＜０．０５）（图３）。三组小鼠条件性恐惧实验僵直反应差异无统计学意义（图４）。
与ＩＤ组比较，ＯＤ组和ＩＳ组海马内乙酰化－Ｈ３和乙酰化－Ｈ４含量明显增加（Ｐ＜ ０．０５）；ＯＤ组和ＩＳ组之间海马内乙酰化－Ｈ３和乙酰化－Ｈ４含量差异无统计学意义；三组间Ｈ３、Ｈ４含量差异无统计学意义（图５）。
与ＩＤ组比较，ＯＤ组和ＩＳ组海马内ＢＤＮＦ含量明显增加及ｃａｓｐａｓｅ－３含量明显减少（Ｐ＜０．０５）；ＯＤ和ＩＳ组之间海马内ＢＤＮＦ及ｃａｓｐａｓｅ－３含量差异无统计学意义（图６）。
讨论
本研究结果显示，异氟醚麻醉＋腹腔探查术可使老年小鼠场景性恐惧实验过程中僵直反应减少，提示损害海马依赖性记忆；而条件性恐惧实验过程中僵直反应差异无统计学意义，提示不影响老年小鼠海马非依赖性记忆；ＰＯＣＤ老年小鼠海马内组蛋白乙酰化含量降低；而ＳＡＨＡ使组蛋白乙酰化水平升高、僵 直 反 应 增 加，说 明ＳＡＨＡ可 明 显 改 善ＰＯＣＤ老年小鼠的认知功能。
ＳＡＨＡ是美国ＦＤＡ批准的第一个应用于临床抗癌治疗的ＨＤＡＣ抑制剂。在阿尔兹海默病等神经退行性疾病动物模型中，急性或长期注射ＳＡ－ＨＡ可以促进认知相关基因表达，增加组蛋白乙酰化、突触可塑性及长时程增强等，从而改善认知功能。但ＳＡＨＡ对ＰＯＣＤ有无改善作用尚不清楚。本研究显示：长期使用ＨＤＡＣ抑制剂ＳＡＨＡ可明显改善ＰＯＣＤ老年小鼠认知功能。
阿尔兹海默病小鼠动物模型研究显示：脑内ＨＤＡＣ表达增加，组蛋白乙酰化水平降低，可导致空间记忆损害。本研究与先前研究结果相似，ＰＯＣＤ老年小鼠恐惧记忆损害同时伴组蛋白乙酰化水平降低。ＰＯＣＤ老年小鼠海马内组蛋白乙酰化含量明显降低，场景性恐惧实验测试过程中僵直反应减少；而长期使用ＳＡＨＡ后，可增加组蛋白乙酰化含量，引起场景性恐惧实验长期记忆测试过程中僵直反应增加，改善ＰＯＣＤ小鼠认知功能。这说明组蛋白乙酰化含量下降在ＰＯＣＤ老年小鼠恐惧记忆下降中起着重要作用。
我们前期研究证实：ＳＡＨＡ丙戊酸可通过抑制脓毒症小鼠组蛋白去乙酰化酶，增加组蛋白乙酰化含量，抑制其下游炎症反应，神经元损伤等，修复受损神经元，增强突触可塑性，改善认知功能。与此一致，本研究发现ＳＡＨＡ可通过增加海马内组蛋白乙酰化－Ｈ３和组蛋白乙酰化－Ｈ４含量，从而上调海马内ＢＤＮＦ及下调ｃａｓｐａｓｅ－３的表达，进而减少神经元损伤，改善认知功能，预防老年小鼠ＰＯＣＤ的发生。
总之，本研究表明组蛋白乙酰化水平降低可能参与ＰＯＣＤ的发病，使用ＳＡＨＡ可改善ＰＯＣＤ老年小鼠的认知功能，其机制可能与增加海马中组蛋白Ｈ３、Ｈ４乙酰化含量有关。
