转基因兔虽然不如小鼠应用的普遍,但对于有些方面的研究是不可替代或者是更适合的。对于模式动物,动脉粥样硬化的主要动物模型就是转基因兔,已有多种相关的因子(如 :人的 apo、poA-1 、 apoB 、 apoE2 、 apoE3 、 HL 和卵磷脂 )在转基因兔中表达,并且对动脉粥样硬化的有关机制提供了新的认识。兔是唯一易被人免疫缺损病毒1型 (HIV-1) 实验性感染的小型动物,人类适当基因的插入可增强其对病毒的易感性和应答;对肿瘤发生的研究,转基因兔也是理想的动物模型。有些实验需要使用比小鼠更大的动物,例如生物化学常常涉及分离纯化程序,而使用小鼠终产物的产率低,兔就是理想的实验动物。转基因兔还可以作为产生各种药物 蛋白的生物反应器,对于这方面的应用,兔比其他大动物具有生长快、成本低、标准化程度高、繁殖周期短的优点。
转基因兔制作的技术要点如下。
( 一 ) 供、受体兔的选择
兔品系的选择要根据实验的目的。供、受体兔均应达到 4 月龄以上初情期出现以后,选择有繁殖史的经产兔作为受体可以避免分娩的困难和仔兔的丢失。
( 二 ) 供体兔的超数排卵和配种
兔的超数排卵有两种方案。
第一种方案 : 在收集胚胎的前 4d, 对供体兔按 20～3OIU/kg 体重肌肉注射 PMSG,72h 后静脆注射 HCG 180IU, 然后进行自然交配或人工授精两次(在 1h 之内),以确保受精的卵母细胞数达到最多。
第二种方案 : 对供体兔每隔 12h 、接连 6 次皮下注射 0.3mg 卵泡剌激素 (FSH),在最后一次FSH注射后 12h,静脉注射 HCG 75IU, 然后进行自然交配或人工授精两次。两种方案的效果相差不大,约可回收卵 20 枚左右。
( 三 ) 受体兔的同步发情
移植前 3 周,将受体兔单独饲养。在供体兔交配的同时,对受体兔一次注射 120IU HCG,然后与结扎输精管的公兔交配,以诱导排卵,从而实现与供体兔生殖周期的同步化。
( 四 ) 受精卵的采集
在供体兔注射 HCG 2Oh 后,进行受精卵的采集。采集的方法有两种。
第一种方法 : 处死供体兔,取出生殖器官(卵巢、输卵管和子富的端部 )。除去输卵管系膜和脂肪组织后 , 用 PBS 通过输卵管漏斗冲洗输卵管。冲洗液置于解剖镜下,收集受精卵。检查卵的质量,淘汰未受精卵和不正常的卵。
第二种方法 : 用甲苯噻嗪一氯胶酮(每千克体重 1.8mg2% 甲苯噻嗪和 15mg10% 盐酸氯胺酮) 对供体兔静脉注射进行麻醉。术部去毛,消毒。在腹中线开口,取出卵巢、输卵管和子宫角。将集卵管(玻璃或塑胶管均可)插入输卵管漏斗约 2cm, 然后将一钝性针头从宫管结合部 插入输卵管内,用 5ml PBS 冲洗输卵管。冲卵后,将卵巢、输卵管和子宫角复位,缝合,消毒。这种方法可以使供体兔重复利用,或继续作正常繁殖用。
( 五 ) 注射基因胚胎的移植
受精卵原核注射的程序与小鼠相同。对受体兔进行麻醉,术部去毛,消毒。在腹中线开口,取出卵巢、输卵管和子宫角,方法与供体兔同。从输卵管漏斗处插入移卵管,将注射基因的胚胎移入输卵管,每个输卵管移植 8～12 枚。移植后,按常规缝合、消毒,待产。仔兔出生后,采样、检测。
注射基因的胚胎也可以采取"自体移植"的方式,即雌兔的受精卵注射基因之后,再移回 这只雌兔自身的输卵管内。自体移植则省略了受体的同步发情等处理过程,同时降低成本、简化操作程序。