作为哺乳类实验动物,猪的个体较大。由于其饲养成本较高、繁殖周期较长,一定程度上制约了在医学实验中的应用。然而由于猪的解剖、生理、生化、代谢等方面与人类的相近性,用猪作为医学实验动物和动物模型近年来呈越来越普遍的趋势。尤其是、各种小型猪品系的建立,促进了这方面的发展。在相当多的领域内,有逐步取代狗的趋势,例如在皮肤烧伤、肿瘤 免疫学、心血管病、营养学、遗传病、牙科、外科等方面的研究。

而应用转基因技术定向地制备动物模型是重要和不可替代的。猪脏器的大小与人类最为相似,所以异种器官移植的研究将猪作为首选动物,经遗传改造的转基因猪有可能成为人类器官移植的供体。用转基因猪作为生物反应器生产医用蛋白质,成为近年来生物技术研究的热门。一些靠自然资源难以得到的蛋白质在转基因猪中表达,例如 : 人免疫球蛋白、血清白蛋白、血红蛋白、生长激素等。在畜牧业,猪是人类肉食品的主要来源。我国是世界上首屈一指的养猪大国,养猪业关系到国计民生。应用转基因技术对猪进行遗传改良,例如 : 提高生长速度、饲料转化率、瘦肉率、提高抗病性、改善肉质等方面,更具有重要的意义。

应用原核注射技术制作转基因猪,由于其生理特点和解剖上的差异,与小鼠、大鼠和土等小动物在操作环节上有较大的差异。小动物一个人就可以操作,而制作转基因猪的工作则须有5～6名分工明确、操作熟练、配合默契的技术人员共同完成。湖北省动物胚胎工程及分子育种重点实验室多年来形成的制作转基因猪的技术程序如图 5-7-7 所示。

( 一 ) 供、受体母猪的准备

用于实验的供、受体母猪要选择 :

(1) 相对净化的猪群,最好是 SPF 级的猪群。然而由于成本的原因,多数实验选择相对净化的猪群即可。

(2)RYR1(Ryanodine receptor) 基因频率低的种群。因为在取受精卵和移植的过程,需要对猪全身麻醉,RYRl 显性的猪在麻醉过程中极易发生应激而死亡。

在进入正式试验之前,至少要进行一个情期的发情观察(断奶母猪除外),以淘汰发情不正常的母猪。认真做好每天的查情记录,以便为超数排卵处理提供准确的时间。

( 二 ) 供体母猪的超数排卵和配种

按本章第二节所述的方法对供体母猪进行超数排卵和配种。用同样的处理方法处理不同品种青年母猪的结果见下表 :

总体效率表明,超排处理可以使母猪的排卵数提高 1 倍左右。

( 三 ) 受体母猪的同期发情 

按本章第二节所述的方法对受体母猪进行同期发情处理。受体与供体同一天内发情和受体比供体迟一天发情,其胚胎移植的效果无显著的差异。

如果采用自体移植的方式,供体自身就是受体,则省掉了同期发情的处理程序。

( 四 ) 确定采集胚胎的时间

更多地获取一细胞期胚胎,对于提高转基因猪的效率是至关重要的。这是因为两细胞期以上的胚胎,不仅注射时操作繁琐,而且整合率低,即使整合了,也是嵌合体。而掌握最适宜的取卵时间,则是提高一细胞期胚胎获得率的关键。

猪是多胎动物,卵巢上众多的卵泡并非在同一个时间全部排卵。从排第一个卵到最后一阶卵间隔的时间 1～7h 不等,平均 4h 左右。在超数排卵处理的情况下,间隔的时间更长。这样就造成同一个时间从输卵管内取出的胚胎,其发育阶段很不一致。樊俊华等人观察的结果 认为,在供体最后一次配种的24h采胚,一细胞期胚胎的比例在 60.7%。

李文化等人对超排母猪的取卵时间,以注射 PMSG 时算起,观察获取胚胎的发育情况如表5-7-3。

从上表可见,在注射 PMSG 后的 124～129h 内取卵,可以得到 95.6% 的一细胞期胚胎。 

( 五 ) 胚胎的采集

1. 器材准备和消毒

将手术所需要的器材 (手术刀、手术剪、止血钳、持针钳、巾钳、缝合针、缝合线、创巾、纱布、表面皿、冲卵管等 ) 高压灭菌。手术前将金属器械浸泡在 0.1% 新洁尔灭液中备用。猪的冲卵管用外径 0.5～1cm,长 10～15cm 的玻璃管弯制而成。

每次手术之前,手术室需用福尔马林高锰酸钾熏蒸消毒。通气之后,再用紫外灯照射。 

2. 麻醉

用 2.5% 戊巴比妥钠 50～100ml 或水合氯醛硫酸镁注射液(水合氯醛8%,硫酸镁5%)150～200ml耳静脉注射,进行全身麻醉。由于个体之间对麻醉药的敏感性不同,所以在注射 时要随时观察猪的反应,注射的速度要慢,而且越到后来越要慢,防止过量。一般在眼睑刚刚失去反应,蹄部剌激无明显反射即可。万一出现麻醉过度,呼吸停止时,要立即注射尼可刹米或肾上腺素,同时进行人工呼吸。抢救及时,一般都还可以恢复过来。

3. 保定

麻醉之后,将猪置于手术台上,仰卧保定。为防止手术过程中猪的挣扎、弹动,要用绳索将四肢和头部捆绑牢靠。为降低腹压,方便手术,手术台要前低(头低)后高(尾高)使腹腔内脏向前倾斜。

4.术部消毒

术部周围剔毛、揩干净,然后皮肤消毒。消毒程序是:3% 腆酊棉球→酒精棉球,由内向外。

5. 手术

在倒数第 2、3 个乳头之间,沿腹中线,尽量避开血管,切开 7～8cm 左右创口,钝性分离自肪和肌肉层,剪开腹膜。先找到子宫角然后循子宫角将一侧卵巢和输卵管引出切口之外。观察卵巢上的排卵点。如果排卵点是"凹"状,表明刚刚排卵,这时候冲出的全部是一细胞期的受精卵,有的卵的边缘还有少部分颗粒细胞。如果排卵点已呈"凸"状,则表明已排卵一段时间了,这时冲出的卵有些已进入二细胞期或四细胞期。统计排卵点的数量,做好记录。一般情况下,一个卵泡内只有一枚发育成熟的卵,有一个排卵点就表明排出了一枚卵。但有时,尤其是在超数排卵处理的情况下,非常靠近的两个或两个以上发育好的卵泡一起排卵,造成排卵点合在一起,造成冲出的卵比排卵点还多的错觉。

6. 冲卵

将冲卵管从输卵管伞部插入输卵管,冲卵管的另一端向下倾斜,置于表面皿上。另一术者用玻璃注射器吸取 38 ℃左右 PBS 液 15ml,并带入 5～8ml空气,将注射器针头从宫管结合部避开细血管插入输卵管内,然后推动注射器。这时,输卵管内的受精卵将随同 PBS 液一起流入表面皿内。一侧输卵管冲卵结束之后,用灭菌生理盐水将暴露在体外的卵巢、输卵管和子宫冲洗干净,送入腹腔。再循着子宫角,将另一侧卵巢、输卵管引出切口之外,用同样的方法冲卵。

冲卵结束后,如果母猪不做受体,即可缝合切口。先向腹腔术部周围撤抗菌素,以防感染。

后四层缝合 : 腹膜、肌肉层、脂肪层和皮肤。最后腆町消毒术部。

如果冲卵后的母猪还要做受体(自体移植),则切口暂不缝合,以消毒纱布浸以灭菌生理水,敷在创口即可。为防止等待过程中母猪苏醒、挣扎 , 可用点滴的方式,向耳静脉缓缓输入合氯醛硫酸镁注射液。

( 六 ) 检卵和离心

将集胚的表面皿置于实体显微镜下,观察卵的形态、大小、发育情况。用吸卵管(吸卵管外径 0.5cm 的玻璃管在酒精喷灯上拉制而成)将正常的卵吸入1.5ml透明的离心管内,未受精卵、发育不正常的卵和四细胞期以上的卵。正常猪的受精卵直径 150µm左右,呈球形,色泽匀称。 由于猪卵细胞质内含有大量脂肪颗粒,原核被浓厚的细胞质包裹,即使在有微分干涉相差（ DIC) 系统的显微镜头下,也无法看见。因此在注射之前必须离心。将盛有 PBS 液和受精卵 离心管置于台式高速离心机内,以每分钟 1.5 万转离心 3～5min。离心的时间,亦要根据卵实际情况而定。离心后要能在卵的赤道线上看清原核,否则要重复离心。

( 七 ) 显微注射和注射胚的体外培养

原核注射的方法与小鼠同。受精卵注射之后,置于 PBS+5%BSA 的培养基中,在 38 ℃ ,5%CO2的环境下做短时间的培养。经过短期培养后将因注射而导致死亡的胚胎淘汰 ( 图 5-7-7 、图 5-7-8)。

( 八 ) 注射胚的移植

受体母猪按供体取卵的方法,麻醉、保定、切开腹部,引出一侧卵巢和输卵管。然后将移卵管从输卵管伞部轻轻插入输卵管,直至壶腹部,将管内的液体全部移入输卵管内,再轻轻拉出移卵管。移卵之后的移卵管,置于实体显微镜下,检查有无余卵。若发现有未移入的卵,要重复上述步骤,再移到另外一侧输卵管。确信管内无余卵后,即可将卵巢、输卵管清洗,送入腹腔,缝合术部,消莓,腹腔注射抗生素。

发育早期的猪胚胎从输卵管进入子宫角后是游动的,最后会基本按等距离排列,并着床于两侧的子宫角内,因此移入一侧输卵管即可。

注射基因后的胚胎,按受体的不同,可分为异体移植和自体移植。

( 一 ) 异体移植

将一头母猪(供体)的受精卵注射基因后,移入另一头母猪(受体)的输卵管内,称之为"异体移植"。魏庆信等人观察了在异体移植的情况下,一头受体母猪移入的最适宜的受精卵数量范围见表5-7-4。

从上表可见,每头受体移入 20～29 枚注射胚,效率最高。

( 二 ) 自体移植

一头母猪的受精卵注射基因之后,再移回这头母猪自身的输卵管内,称之为"自体移植",魏庆信等人分组观察了移入卵的不同数量,对转基因效率的影响,见表 5-7-5。

从表中可见,在自体移植的情况下,每头受体以移入 16～20 枚注射卵的效率最高。 

( 三 ) 自体移植与异体移植的比较 

魏庆信等人对自体移植和异体移植的效率进行了比较,如表 5-7-6。

由上表可见,自体移植在移入胚数基本一致的情况下,其受孕率和产仔率分别比异体移植提高了 30.7%(P<0.05) 和 15.1%(P<0.01)。同时节省了一半试验动物,简化了操作程序。