基因敲除 (gene knockout) 又称基因打靶 (gene targeting),是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。通过对生物活体遗传信息的定向修饰(包括基因灭活、点突变引人、缺失突变、外源基因定位引入、染色体大片段删除等),并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传并 表达突变的性状,从而研究基因功能等生命科学的重大问题,以及提供相关的疾病治疗、新药 席选评价模型等。基因打靶技术的产生和发展建立在胚胎干细胞和同源重组技术的基础之上。

同源重组的概念是 20 世纪 70 年代初在酵母研究中发展起来的,与酵母完全不同的是,哺乳动物细胞中同源重组的概率非常低,直到 1985 年 ,Smithies 等人才首次报道在人类肿瘤细胞中实现了人工打靶载体和内源β-球蛋白基因间的同源重组。1987 年,Smithies 和 Capecchi 的研究小组在小鼠 ES 细胞中分别实现了Hprt(次黄嘌呤磷酸转移酶) 基因的定位剔除,并各自在权威性的 Nature 和 Cell 杂志上向世界公布了他们的成果,这标志着基因打靶技术的诞生。短短的 10 多年时间里,基因打靶技术革命性的改变了生命科学研究的面貌,成为研究基因功能的有力手段。在基因打靶技术十多年的发展和应用过程中,呈现出几个明显的发展趋势。一是通过条件型基因剔除技术在时间和空间上对基因敲除进行调控,使引入的基因能够在特定组织、特定发育阶段或特定的诱导条件下表达。在这方面尤以基于Cre-LoxP重组酶系统应用的最为广泛。二是发展满足大规模基因功能研究需要的随机基因敲除技术,一种称为基因诱捕 (gene traping) 的策略得到了广泛的应用。利用基因诱捕可以建立一个携带随机插入突变的 ES 细胞此,节省大量筛选染色体组文库以及构建特异性打靶载体的工作和费用,从而能更有效、更迅速的进行小鼠染色体组的功能分析。三是通过基因敲人(gene knock-in) 技术在基因组中引入精细突变以研制精确模仿人类疾病的动物模型。"Hit and Run"法、"Tag and Exchange" 法以及基于重组酶系统的方法是目前较为常用的用于诱导精细突变的方法。目前,小民的基因敲除已经达到定时、定位、定点的水平。1996 年 Wilmut等人研究成功体细胞核移植技术,为哺乳动物的基因敲除提供了一条新的技术路线。应用体细胞核移植与基因打靶技术不仅得到了敲除基因的小鼠,而且美国密苏里大学和英国 PPL 公司还分别于 2001 年构建成敲除了部分α-Gal基因的克隆猪。

以胚胎干细胞为受体细胞的基因敲除技术程序如下。

( 一 ) 打靶载体的构建

把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的 DNA 分子重组到带有标记基因(如 neo 基因,tk 基因等)的载体上,此重组载体即为打靶载体。常用的打靶载体根据目的的不同有两种。

1. 置换型载体 (Ω型 )

为了使某一基因失去其生理功能,这时所要设计的置换型打靶载体应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的 DNA 片段及标记基因等成分。在打靶过程中,断裂位点位于同源序列的外侧或两侧,选择基因位于同源目的序列内部或外侧,载体DNA 同源目的序列与染色体 毗点发生两次同源重组。载体的同源序列取代染色体靶位序列。

2. 插入型载体 （O 型）

如为了把某一外源基因引人染色体 DNA 的某一位点上,这种情况下应设计的插入型载体要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及标记基因等部分。在打靶过程中,断裂位点位于同源序列内,选择基因紧邻同源目的序列,载体 DNA 同源序列与染色体靶位点发生一次同源重组,整个载体整合到染色体靶位点上。

打靶载体构建的基本过程如图5-7-10所示。

由于打靶载体必需含与靶基因严格同源的序列,这些序列应该是克隆自 ES 细胞系的”同基因的 (isogenoc)"DNA。用作基因打靶的大多数 ES 细胞系都是建立于129 品系小鼠,所以最好是用129 品系的序列做成打靶载体。

( 二 ) 导入受体细胞

目前为止,打靶载体导人受体细胞的方法通常有电穿孔、显微注射、 DEAE 介导、磷酸钙沉淀、脂质体转染和病毒载体等方法,使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将打靶载体中的 DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。各种方法各有优缺点。如脂质体转染和病毒载体法对细胞的损伤小,显微注射法命中率高,电穿孔法步骤简单、人为因素少,常用的是电穿孔法。

电穿孔法 : 胚胎干细胞在继代移种后两天换培养基,换培养基 4h 后作电穿孔转移,这可确保细胞在转染期间尽可能迅速生长。①缓冲液 : 正常的 ES 细胞培养基(含 15% 胎牛血清和 0.1mmol/L β- 琉基乙醇的高葡萄糖 DMEM)。该培养基不妨碍转染和打靶效率,而防止细胞在电击情况下所发生的应力。②电转移参数 : 在室温下或冰浴中都可很好进行电转移。每毫升培养基用 107～108 个细胞。为减少串接整合, 打靶的 DNA 片段浓度不要高于 5mmol/L。用 800V/cm 和 200µF的条件,将有大约 50% 的存活。电转移处理 2min 后,细胞需要重新移种。

处理细胞要轻柔,不要离心。

( 三 ) 同源重组细胞克隆的筛选

打靶载体导人受体细胞后,要进行同源重组细胞克隆的筛选。其筛选的方法有 PCR 筛选法、正负筛选法和无启动子筛选法一般用正、负筛选法。正选择基因(多为neo)在随机整合同源重组中均可正常表达,负选择基因在靶基因的同源区外位于载体3'末端(常用HSV

-tk)因为大多数随机整合是外源 DNA 在染色体 DNA 末端的整合,因此整合后保留 3'未端基。载体 DNA 在与染色体 DNA 发生同源重组以后,载体末端的 HSV-tk 在同源区外,不参与整合而被丢失。tk 可使丙氧鸟昔转变为毒性核苷酸,可用丙氧鸟苷筛选得到同源重组的细胞,排除随机整合细胞株。用 G418 作正选择,筛出含有 neo 基因的细胞株,再用丙氧鸟苷做负择淘汰含tk基因的细胞株,保留不含 tk 基因的同源重组细胞株。原理见图 5-11。图中I示正、负选择 DNA;Ⅱ表示染色体 DNA;I、Ⅱ斜线部分为两者同源区;A 、B表示染色体上的两个基因;E 表示载体上的外源基因;neo 表示 G418 抗性基因,即正选择基因;HSV-tk 表示载 体上负选择基因,表达 HSV-tk的细胞能为丙氧鸟苷致死。

( 四 ) 生殖系嵌合体的筛选

上述方法得到的嵌合体动物,并非都嵌合在生殖系细胞上。如果嵌合不是发生在生殖系细胞,则不能建系。因此首先要通过传代检测,筛选出生殖系嵌合体。将正常野生型鼠与嵌合体交配,如果后代中有基因敲除的仔鼠,则表明该亲本嵌合体动物是生殖系嵌合体。否则不是生殖系嵌合体,需淘汰。

筛选出生殖系嵌合体动物之后,即可通过生殖系嵌合体的子代建立繁殖家系,生产基因敲除的小鼠。生殖系嵌合体与正常野生型鼠交配所得到的 F1 代为杂合体,将杂合体与杂合体交配,则能在子代中获得 1/4 的纯合体。纯合体的筛选和基因敲除品系的建立见"九、转基因动物品系的建立"。