RNA 干扰 (RNA interference,RNAi) 是双链 RNA(dsRNA) 介导的特异性基因沉默 (gene si- lencing) 现象,是真核生物中普遍存在的古老而保守的自身防御机制和内源性基因表达调控机制。1998 年 Fire et al首次发现将 dsRNA 注入线虫(C.elegans)可特异性抑制基因表达,并将这种由 dsRNA引发的基因表达抑制现象称为RNA干扰(Fire et a1,1998)。随后,RNAi的基础和应用研究迅速成为 21 世纪初生命科学中的热点领域。2001年和 2002 年 RNAi 研究连续两年入选美国《科学》杂志评定的年度自然科学十大突破。短短几年时间,关于 RNAi 的基础和 应用的研究就取得了突飞猛进的进展。现已阐明 dsRNA 引发的基因沉默效应主要发生在细

胞质内,其大致过程是 : ①外源或内源性转录生成的 dsRNA 被一种 RNaseIII类的核酸酶 Dicer

切割成 21-24bp 的短干扰性 RNA(short interfering RN,siRNA);② siRNA 与其他蛋白因子作用,形成 RNA 诱导的沉默复合物(RISC,RNA-induced silencing complex);③双链 siRNA 在RISC 中被转变成单链,该单链 siRNA 识别同源的靶 mRNA,而另一条单链分子离开 RISC 复合物后,可能被降解;④RISC切割 siRNA 覆盖的靶 mRNA 区域,从而导致靶 mRNA 的降解和相应基因的沉默效应(Hammond et al,2000;Zamore et a1 2000;Tomari and Zamore,2005)。

RNA 干扰技术在相对低等的真核生物中,比如锥虫、线虫和果蝇等,应用最为广泛深人,尤其在线虫,已经实现了全基因组水平的大规模、高通量的基因沉默,成为线虫遗传学的基础 研究工具和应用平台。比较而言,RNA 干扰在哺乳动物上的进展则曲折的多。早期研究发现,向哺乳动物体内导入 dsRNA,将激活 RNA 依赖性的蛋白激酶,引发强烈的干扰素反应,导致体内 mRNA 的非特异性降解,全面抑制所有蛋白的合成。这从根本上限制了 RNAi 在哺乳动物中的应用。后来发现导入的 dsRNA 小于 3Obp 时,既能特异性沉默内源基因,又可逃避干扰素反应通路,而当引人 dsRNA 长度为 21bp 时,基因沉默效应最为有效。这使得 RNA干扰 的研究进入了哺乳动物时代。哺乳动物中最初的RNA干扰研究是在细胞水平进行的。即针对靶基因,设计并体外合成21坤的双链siRNA(小干扰 RNA), 转染体外培养的细胞 , 然后观 察细胞代谢及表型的异常,从而确定靶基因的功能。此方法有两大弊端,一是 dsRNA 的合成费用非常昂贵,二是由于哺乳动物缺乏 siRNA 的内源扩增机制,因此基因沉默效应是暂时性 的,一旦导入的 dsRNA 耗尽,基因沉默效应也就随之消失。2002 年 Brummelkamp et al(2002) 模拟和借鉴 RNA 干扰的机制,利用 RNA 聚合酶III启动子和发夹结构,发明了一种 siRNA 表达载体。该载体转染细胞后,将转录出具有发夹结构的小 RNA 分子,而发夹结构中的双链部分可被 Dicer 酶识别并切割,形成有功能的 siRNA,从而持续稳定的沉默靶基因。这一发现一方面规避了昂贵的 dsRNA 合成,使RNA干扰实验变得更加经济;更重要的是,它实现了 siRNA 的持续表达,极大的拓宽了 RNAi 的应用范围。同年,McCaffrey et al以及 Hasuwa et al应用siRNA干扰载体,成功获得了RNA干扰的小鼠,在动物个体水平上实现了基因沉默,证明了RNA干扰技术用于转基因动物研究的可行性(McCaffrey et al,2002;Hasuwa et al.,2002)。这一进展具有重大意义。一方面,它标志着一种新的转基因动物制备方法的诞生;另一方面,传统基因敲除小鼠的制备实验周期长、技术难度大、费用也相当昂贵,而应用 RNA 干扰制备转基因动物则无论经济还是技术上都有很大的优势。尤其 RNA 干扰动物表现的基因沉默效应在表型上与相应基因敲除动物具有一致性,因此,应用 RNA干扰制备的基因沉默小鼠可以在很大程度上替代传统的基因敲除小鼠,这对后基因组时代的哺乳动物基因功能研究具有重要意义。最近,siRNA干扰载体的设计又有了新的进展,kasim 等人(2004)将loxP 序列插入 siRNA载体的环状结构区,利用 cre-loxP 重组系统实现了siRNA 的诱导性表达,另外的一些学者将能够被强力霉素(doxycycline)或蜕皮素(ecdysone)激活的特殊转录因子与 RNA 聚合酶Ⅲ启动子整合在一起,构建了可诱导的siRNA 表达载体,使人们能够按照自己的意愿控制 siRNA 的表达与否,将基于载体的RNA 干扰提高到了一个新的水平,也使得条件型基因沉默小鼠的构建成为可能 (van de Wetering et al,2003;Gupta et al,2004)。目前 RNA 干扰技术已经成为在分子、细胞及个体水平研究基因功能、调控以及发现新基因的有力工具,渗透到了发育生物学、分 子生物学、分子遗传学的各个分支,并在人类疾病模型、基因治疗、新药研发等与人类健康密切 相关的领域以及畜牧遗传育种等诸多领域展示了诱人的应用前景。

RNAi 转基因动物技术体系主要包括基因沉默载体 (siRNA 干扰载体)的构建、转基因动物制备和转基因动物基因沉默效应的评估三个主要技术环节,其中以 siRNA 干扰载体的设计和构建最为关键。目前应用最广泛的干扰载体是基于茎环发夹结构 (hairpin stuctu 时的干扰载体,早期研究认为茎部长度为 21bp的发夹结构与细胞内源的 siRNA 结构最为相近,基因沉默效应也最高,最近却有研究发现,茎部长度为 27 或 29bp 时,引发的基因沉默效应可能显著增加,甚至百倍于传统的 21bp 茎环结构 (Kim et al,2005;Siolas ea al,2005)。其技术程序如图 5-7-15。