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摘要：目的 探讨不同妊娠期振动对大鼠子代空间学习记忆的影响。方法 分别在ＳＤ大鼠妊娠的１～７ｄ、８～１４ｄ、１５～２１ｄ施加强弱交替的振动刺激，在子鼠６０ｄ使用Ｂａｒｎｅｓ迷宫测试其空间学习记忆能力，比较各组间空间学习记忆的差异。结果 学习过程：１）探索路程：妊娠早期振动组在第４天，妊娠中期在第１天，妊娠晚期在第１天高于对照组，妊娠晚期在第２、３天低于对照组（Ｐ＜０．０５）；２）探索平均速度：妊娠早期在第２天，妊娠中期在第１、２天，妊娠晚期在第１、２、３、７、８天均低于对照组（Ｐ＜０．０５）；３）错误探索时间：妊娠早期在第１、３、４、７、８天，妊娠中期在第３、４、５、８天高于对照组，妊娠晚期在第２、６天低于对照组（Ｐ＜０．０５）；４）首次探索目标洞潜伏期：妊娠中期在第５天高于对照组（Ｐ＜０．０５）。记忆过程：妊娠早期振动组的错误探索时间明显高于对照组（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ＝４３．００，Ｐ＝０．０００），妊娠晚期振动组的探索路程（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ＝１５０．００）、平均速度（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ＝１５０．００）和错误探索时间（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ＝１６４．５０）明显低于对照组（Ｐ＜０．０５或＜０．０１）。结论 妊娠早期振动损害子代的空间学习记忆能力，妊娠晚期振动可能促进子代的空间学习记忆能力，而妊娠中期仅损害子代的空间学习能力。

关键词：妊娠期振动；Ｂａｒｎｅｓ迷宫；空间学习记忆能力　　

应激（ｓｔｒｅｓｓ）是指有机体在生理或心理上受到 威胁时出现的一种非特异的身心紧张状态，可分为生理应激和心理应激。应激对机体的影响因其自身的强度和频率、发生的时间、应对策略的不同而不同。一般认为适度强度和频率的应激对机体是有益的，应激发生在机体相对不应期对机体影响不大，应激后合理的应对策略可缓解应激的影响。妊娠期应激由于其发生的特殊时相，在唤起母体的焦虑抑郁情绪的同时，影响胎儿的生理和心理发育进程，进而造成子代认知发展的延迟，引起空间学习记忆能力的下降。现有研究表明，机体在不同的妊娠期遭受应激对子代认知发展的影响是不同的，母孕早期遭受重大负性生活事件刺激可能损害子代的空间学习记忆策略，造成子代学习记忆障碍。动物实验亦发现妊娠早期遭受应激的豚鼠子代空间学习记忆能力受损，而妊娠晚期应激组子代的空间学习记忆能力反而提高。但也有学者认为实验大鼠在妊娠晚期遭受束缚应激损害了子鼠的空间学习记忆能力。研究结果的差异究竟是因为应激强度和频率的不同，还是应激时相的不同，需要进一步研究确定。本研究拟使用强弱交替的振动作为躯体应激源，分别施加于妊娠早、中、晚期孕鼠，观察子鼠的空间学习记忆能力是否受到损害，以期为妊娠期保健措施的制定提供线索。

１　材料和方法

１．１　实验动物及分组　研究对象为性成熟而未交配的成年Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠，雌性２４只，体重（２４３±１０）ｇ，雄性１２只，体重（３０６±１０）ｇ，由广东省动物实验中心提供，饲养于中山大学公共卫生学院ＳＰＦ级动物房：１２ｈ明亮／黑暗交替，温度为（２１±１）℃，湿度为５０％±１０％，随意进食和饮水。ＳＤ大鼠先在检疫室里检疫７ｄ，然后在饲养室内适应３ｄ，再分两批按照雌雄比例为１∶１进行合笼，中间间隔３ｄ。为了避免对妊娠鼠造成不必要的应激刺激，合笼后的大鼠直接默认为妊娠第１天。使用随机数字表将雌性大鼠分为４组：妊娠早期振动组、妊娠中期振动组、妊娠晚期振动组和对照组（对照组不接受振动刺激，常规饲养至分娩）。动物实验已通过中山大学实验动物中心实验动物伦理委员会审查，实验人员自觉遵守实验动物福利伦理原则。

１．２　振动模型建立　参考国内学者有关地震模型的制备过程，实验人员利用自制强振动装置和ＨＹ－４往返式震荡仪制作了振动刺激模型，具体刺激参数如下：１）强振动刺激：在应激时相的第１、３、５天上午的１２：００～１：００和下午的６：００～７：００利用自制强振动装置进行强振动刺激，包括垂直振动（振幅为１０ｃｍ，时间３０ｓ，１００次／ｍｉｎ）和水平振动（振幅为１０ｃｍ，时间为３０ｓ，１００次／ｍｉｎ），人工操作；２）弱振动刺激：在应激时相的第２、４、６、７天上午的１２：００～１：００和下午的６：００～７：００利用震荡仪改装的弱振动装置进行弱振动刺激，频率２００次／ｍｉｎ，时间３０ｍｉｎ，具体应激时相为：妊娠早期（妊娠１～７ｄ）、妊娠中期（妊娠８～１４ｄ）、妊娠晚期（妊娠１５～２１ｄ））。施加振动刺激后，将妊娠母鼠４只一笼饲养至２０ｄ，分笼等待分娩，分娩后子鼠饲养至２８ｄ断奶并剔除畸形及体重过轻的个体，编号后利用随机数字每组筛选２４只（雌鼠１１只，雄鼠１３只），标准饲养至６０ｄ进行迷宫测试。

１．３　Ｂａｒｎｅｓ迷宫装置　参考Ｂａｒｎｅｓ　ＣＡ的Ｂａｒｎｅｓ迷宫装置参数并结合实验室实际条件，本实验用Ｂａｒｎｅｓ迷宫分为三部分：１）迷宫装置：由圆形实验平台、起始盒和躲避盒组成，其中圆形实验平台直径为１１０ｃｍ、厚度为１ｃｍ，高度为５０ｃｍ，外周有２０个直径为１０ｃｍ躲避洞，材质为黑色磨砂亚克力板；起始盒为长宽高均为２０ｃｍ的黑色不透明盒子，作为子鼠实验开始前的适应场所；躲避盒为高４０ｃｍ，长和宽均为１０ｃｍ的黑色不透明盒子，实验时放置于固定方位洞口下方，作为子鼠的躲避场所。２）厌恶刺激装置：由两个功率为１　０００Ｗ的吹风机组成，固定于２ｍ高的不锈钢支架上，以发出的噪音和热风作为厌恶刺激。３）录像装置：由固定于２ｍ高的不锈钢支架上的摄像头和视频分析系统（视频采集卡、视频分析卡和视频分析软件组成。（购于上海欣软公司，型号：ｓｕｐｅｒｍａｚｅ　Ｖ２．０））构成。

１．４　Ｂａｒｎｅｓ迷宫测试　参考Ｘ　Ｌｉ等的实验设置，本实验程序如下：将子鼠放于Ｂａｒｎｅｓ迷宫平台中央的起始盒中，１０ｓ后移走起始盒，子鼠以随机方向开始探索迷宫，同时打开吹风机和图像采集分析系统，记录４ｍｉｎ。若子鼠回避厌恶刺激而成功进入躲避盒则停止记录并关闭吹风机，使其躲避盒中适应１ｍｉｎ，以形成入洞则厌恶刺激消失的条件反射；若子鼠在４ｍｉｎ内未进入躲避盒，则由实验者引导进入，并令其在躲避盒中适应１ｍｉｎ。每次实验间隔用７５％酒精擦拭迷宫表面和躲避盒并转动迷宫，消除上次实验过程中子鼠遗留的气味和排泄物线索，确保实验子鼠通过自身空间记忆线索找到目标洞。在子鼠连续９ｄ、每天学习１次的整个过程中，目标洞始终固定于同一方位，室内空间记忆线索（实验人员、实验室的门和实验桌椅）保持不变。在第１０天，移除目标洞，子鼠自由探索迷宫４ｍｉｎ，测试其空间记忆能力。

测试指标由ＳｕｐｅｒＭａｚｅ　Ｖ２．０视频分析软件自动生成，包括：总路程（子鼠进入目标洞前总探索路程，路程越长，说明空间探索能力越差）、平均速度（子鼠探索迷宫的平均速度，速度越快，说明学习记忆效率越高）、探索目标洞的潜伏期（子鼠首次将鼻子或前肢探向目标洞的时间，时间越短，提示空间定位能力越好）和错误探索时间（子鼠将鼻子嗅向非目标洞或前肢进入任何一个非目标洞，包括专注于探究同一个非目标洞的时间总和，时间越短，提示其空间学习记忆能力越好）。

１．５　统计学方法　利用Ｓｕｐｅｒｍａｚｅ　Ｖ２．０动物行为学视频分析系统进行图像采集及数据粗处理，进一步使用Ｅｘｃｅｌ表整理数据，使用ＳＰＳＳ　１３．０软件进行统计分析，数据以中位数±四分位间距表示，分别使用Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ　Ｈ检验进行多个样本的比较和Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ检验进行两两比较，显著性水准为α＝０．０５。

２　结　果

２．１　空间学习过程

２．１．１　探索路程 妊娠早、中、晚期应激组和对照组的探索路程均随学习天数的增加而减少（χ２＝２２．３５、２０．０４、２２．５７、２１．２３，Ｐ＜０．０５或＜０．０１）；四组在学习过程的第１、２、４天探索路程存在差异（χ２＝１５．５９、１１．７１、１５．７４，Ｐ均＜０．０１），其中妊娠早期振动组在第４天，妊娠中期振动组在第１天高于对照组，妊娠晚期振动组在第１天高于对照组，在第２、３天低于对照组。见图１。其他学习天数各组子鼠探索路程间比较差异无统计学意义，说明在学习过程的早期，妊娠早、中期振动组子鼠空间探索能力比对照组差，而妊娠晚期振动组子鼠空间探索能力比对照组强，随着学习次数增加，上述差异消失。

２．１．２　平均速度 比较妊娠早、中、晚期振动应激组和对照组子鼠在迷宫中的平均探索速度，结果显示随着子鼠学习天数的增加，平均速度均有提高（χ２＝２６．４５、２８．３６、２０．２２、２４．６６，Ｐ＜０．０５或＜０．０１）；其中，在学习过程的第１、２、４、９天，四组探索的平均速度差异有统计学意义（χ２＝１５．２８、９．５２、１１．９３、９．１８，Ｐ＜０．０５或＜０．０１），妊娠早期振动组子鼠在学习过程的第２天、妊娠中期振动组在第１、２天、妊娠晚期振动组在第１、２、３、７、９天的探索速度均低于对照组。见图２。提示妊娠早、中期振动组子鼠在学习早期出现较差的学习效率，至学习晚期差异消失，而妊娠晚期振动组子鼠学习效率存在波动，学习效率差于对照组的天数较多，并断续至学习的第９天。

２．１．３　首次探索目标洞潜伏期 妊娠早、中、晚期应激组和对照组的首次探索目标洞潜伏期均随着学习天数的增加而缩短 （χ２＝３０．８６、２１．４２、３５．０５、２５．５７，Ｐ均＜０．０５或＜０．０１）；在学习过程的第５、７天，四组的首次探索目标洞的潜伏期是不同的（χ２＝８．１３，１２．１８，Ｐ＜０．０５或＜０．０１），说明不同妊娠期振动对子代空间定位能力的影响是不同的，妊娠中期振动组子鼠在学习过程的第５天明显高于对照组。见图３。说明妊娠中期振动对子代的空间定位能力影响较大。

２．１．４　错误探索时间 妊娠早、中、晚期应激组和对照组的错误探索时间在学习过程中均随学习天数呈现下降趋势（χ２＝３４．２９、１６．４７、１９．４９、３０．５４，Ｐ＜０．０５或＜０．０１）。在学习过程中的第１、２、３、４、６、７天，四组的错误探索时间差异有统计学意义（χ２＝８．７５、１５．５０、１２．５８、１６．９７、９．７１、１６．３０，Ｐ＜０．０５或＜０．０１），说明不同妊娠期振动影响子代空间学习能力，在第８天后所有组学习效果稳定。妊娠早期振动组子鼠的错误探索时间在学习过程的第１、３、４、７、８天，妊娠中期振动组在第３、４、５、８天均高于对照组。见图４。说明妊娠早、中期振动损害空间学习能力。

２．２　空间记忆测试　在记忆测试中，发现妊娠早期振动组 的 错误探索时间明显高于对照组 （Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ＝４３．００，Ｐ＝０．０００），妊娠晚期振动组的探索路程（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ＝１５０．００）、平均速度（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ ＝１５０．００）和 错 误 探 索 时 间（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ＝１６４．５０）明显低于对照组（Ｐ＜０．０５或＜０．０１）。见表１。说明妊娠早期振动损害子代的空间记忆能力，而妊娠晚期振动可能提高子代的探索能力和空间记忆能力，但记忆效率较低。

３　讨论

本研究分别在大鼠妊娠的早、中、晚期对其施加强弱交替的振动刺激，在子鼠出生后６０ｄ对其进行Ｂａｒｎｅｓ迷宫测试，检测其空间学习记忆能力，结果发现妊娠早期振动损害子代的空间学习记忆能力，而妊娠晚期振动可能促进子代的空间学习记忆能力。

３．１　妊娠早期振动对子代空间学习记忆能力的影响 妊娠早期振动引起子代大鼠探索能力的下降、学习效率的降低，造成子代的空间学习记忆能力的损害，这与国内童建斌等的研究是相同的，对妊娠５ｄ和１８ｄ的昆明小鼠施加被迫游泳应激，发现妊娠５ｄ应激组的子鼠成年后海马ＣＡ１和ＣＡ３区海马神经元密度比妊娠１８ｄ应激组明显下降，说明早期应激 对 子 代 学 习 记 忆 能 力 的 影 响 比 晚 期 应 激大。其可能机制是妊娠期应激引起应激相关激素（糖皮质激素和５－ＨＴ等）的释放，影响记忆加工重要脑区－海马的发育，造成灵活的空间学习记忆策略的损害，表现为对新事物接受缓慢、学习内容的减少和学习方式的不灵活，引起子代的空间学习能力障碍。如国内毛凤霞等发现在妊娠期给予大鼠束缚刺激，造成子鼠海马组织中ＢＤＮＦ（脑源性神经因子）的表达减少，影响仔鼠的学习记忆和行为活动。国外亦有相关报道，如Ｊ　Ｙａｎｇ等发现妊娠期应激改变胎儿海马区突触的可塑性和提高急性应激对海马突触可塑性的影响，这可能是子代大鼠空间学习记忆受损的机制。

３．２　妊娠晚期振动对子代空间学习记忆能力的影响 妊娠晚期振动虽然引起子代探索能力和空间学习记忆提高，但学习效率却明显降低。这与国外ＡＫａｐｏｏｒ等的研究相似，在豚鼠妊娠的５０ｓ（５０ｄ、５１ｄ、５２ｄ）和６０ｓ（６０ｄ、６１ｄ、６２ｄ）的９：００～１１：００暴露于高频闪烁灯下，结果发现５０ｓ组的空间学习记忆能力受到损害，而６０ｓ组的空间学习能力则提高，这说明妊娠晚期应激可能提高子代的空间学习记忆能力。所以可认为，在妊娠晚期施加适度的强弱交替 的 振 动 可 能 有 利 于 子 代 空 间 学 习 记 忆 的发展。

综上所述，妊娠期应激对子代的空间学习记忆的影响存在敏感时相，越早期接受应激对子代空间学习记忆能力的影响越大，而越晚期应激虽然有可能促进子代空间学习记忆能力的发展，但学习效率却明显下降。

４　不足和展望

本研究对不同妊娠期孕鼠经历振动应激后子代的学习记忆能力进行了初步探索，所得结果揭示了妊娠期应激存在敏感时相，对子鼠学习记忆的影响亦有差别。然而研究设计尚有不完善的地方：第一，振动时孕鼠的行为表现未加以记录并描述；第二，孕鼠在振动后的情绪反应和生化指标的变化也未进行评价；第三，子鼠的体重、畸形未纳入分析。在今后的研究中应该对孕鼠遭受应激后的行为表现和情绪反应做定量或定性分析，将子鼠的体重变化和畸形率纳入分析，以揭示妊娠应激对亲代和子代影响的复杂机制。

附录1

Barnes（巴恩斯）迷宫

产品描述：

Barnes（巴恩斯）迷宫是美国学者Carol A Barnes1979年发明的用于检测动物空间记忆的模型。与水迷宫和放射臂迷宫类似，巴恩斯迷宫利用啮齿类动物避光喜暗且爱探究的特性而建立的。动物获得的强化是从一个光亮、敞开的平台上面逃往位于平台下面的一个黑暗、狭小的箱里，该箱称为目标箱。经过训练，动物学习并记忆目标箱的位置。该模型对动物的应激性刺激较小，既不像放射臂迷宫（八臂迷宫）那样需要禁食，也不像水迷宫那样应激性强。因此，在记忆研究中较为常用。尤其适用于与应激相关的记忆研究以及基因敲除小鼠的行为表型研究。

系统配置：

软件系统：

l 标准化工业设计，硬件美观耐用

l 无须给实验动物染色，软件自动跟踪识别

l 独特的动态背景识别算法，有效保证识别的抗干扰性和准确性

l 支持跟踪识别多个实验动物，提升实验效率与准确性

l 用户可设置彼此独立的实验数据存档文件夹， 便于实验资料（包括存盘录像与数据）管理

l 软件界面人性化，操作说明详细，指标功能丰富

l 采用视频摄像跟踪技术，实现了实验过程的自动化，避免了人工计数引入的主观误差和对实验动物  的干扰，增加了实验结果的真实性和可靠性。

l 完善的实验控制功能 ，可以随时调入以往实验项目，可继续进行实验和数据查看及导出操作。实验结束后可立即查看分析该次实验的各项数据，回放录像，轨迹可输出为标准的位图文件，数据可输出到Excel文件，方便分析。

l 特有的事件记录器，随时跟踪实验人员的软件操作，自动提示，便于远程维护

硬件系统：

指标参数：

实验方法：

1． 实验开始前一天，将动物单个从目标洞置于躲避盒（目标箱）内适应4min。

2． 将动物置于迷宫中央的起始盒内限制活动5s。

3． 移开起始盒，启动软件，实验者在挡帘后进行观察。动物四肢均进入目标箱，则计为一次逃避（escape）,并让动物在箱内停留30s。每一动物一次最多观察4min。在此期间如果动物仍然找不到目标箱，则将动物从迷宫移开，放入目标箱内并停留30s。利用这一间隙清洁迷宫。动物每天训练两次，连续5~6d。

4． 从第二次训练开始，每次训练之前将迷宫随机转动一至数个洞的位置，但目标箱始终固定在同一方位。这样做的目的是防止动物依靠气味、而非凭借记忆来确定目标洞的位置。

实验记录以下参数：探究任何一个洞的潜伏期、到达目标箱的潜伏期和每只动物的错误次数（一次错误定义为动物把头伸向或探究任何一个非目标洞，包括专注于探究同一个非目标洞）。

注意事项：

1． 动物记忆力减弱，主要表现为动物成功获得一次逃避之前的错误次数比对照组增多，其次到达目标箱的潜伏期延长；探究任意洞的潜伏期可以延长，也可没有明显变化。记忆力增强则表现相反，即错误次数减少，到达目标箱的潜伏期缩短。

2． 动物在迷宫遗留的气味对下一只动物的迷宫操作影响很大。因此，除在两次训练之间旋转迷宫外，还要用70%酒精清洁迷宫，以消除残留气味对下一只动物的导向作用。

3． 巴恩斯迷宫平台类似一个大敞箱（open field），任何影响敞箱行为（自发活动）的因素（例如药物处理或基因改变）均可影响实验结果。

4． 品系差异   小鼠的爱探究特性使其成为巴恩斯迷宫研究的理想动物，但不同品系的小鼠在该实验中的行为表现差别很大。例如，129S6小鼠在巴恩斯迷宫中很少有探究行为，因而很难找到目标洞。而C57BL/6J小鼠则有相当多的探究行为，适合于巴恩斯迷宫实验。这一点在基因改变小鼠的记忆研究中尤其要注意。

来源：上海欣软信息科技有限公司