( 一 ) 水纯化装置

胚胎培养对水质的要求很高。用于胚胎操作的各种培养基一般都要用五蒸水来配制,其他溶液也至少用双蒸水或三蒸水配制。目前常用的是石英玻璃自动纯水蒸馏器,其中有自动双重纯水蒸馆器、自动三重纯水蒸馏器等。制备五蒸水,可先双蒸,再三蒸。

也可用超纯水装置制备纯水。超纯水装置主要由数个过滤部件组合而成。水先经过预过滤 层除去粗杂质,然后经过去有机层、去离子层、去热原层,再经过 0.22µm 微孔滤膜过滤除菌。

( 二 ) 超净工作台

超净工作台是以空气过滤去除杂菌抱子和灰尘颗粒来达到空气净化目的的装置,主要由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯等部分组成。超净工作台有单人和双人使用的两种,根据气流方向的不同,又分为侧流式(也称垂直式)和平流式(也称外流式)两类。侧流式超净工作台 , 净化的空气由一侧流向对侧,也有从上(下)向下(上)的,从而形成气流屏障来保持工作区域无菌。平流式超净工作台,净化的空气由后侧面向外(朝着操作者)流动,因而使外面气流不至于混入操作区域。一般配制试剂、接种、过滤溶液等工作可在超净工作台上进行。使用前应提前用紫外灯照射,并开机吹 30min 后再开始操作。

( 三 )CO2培养箱

CO2培养箱是在恒温培养箱的基础上增加了调节湿度和 C02 浓度的功能。C02 培养箱水套式和气套式两种。水套式 C02 培养箱,通过箱体夹层中的水加热保持恒温,夹层中的水要用蒸馏水。气套式 C02 培养箱通过加热组件保持恒温,加热组件环绕所有外夹套,能均匀加热并用玻璃纤维绝缘包装,箱体不需注水,与水套式相比重量轻。在使用 C02 培养箱之前需用酒精棉球将培养箱的内壁和架层擦拭消毒,待酒精挥发尽之后,关上箱门,开始使用。动物胚胎培养的温度设置在 37～38℃(根据不同的动物胚胎而略有区别),CO2浓度设置在5%,CO2 培养箱所使用的C02的纯度应达到 99.99% 以上。如果培养箱的湿度要求 100%,可在C02 培养箱内的底部上放一盛有蒸馏水的托盘即可。使用操作程序如下。

(1) 在使用该设备之前,先对该设备进行内外消毒。

(2) 接通电源,首先给恒温箱水套灌冲灭菌蒸馏水,将漏斗置于高出注水口的位置后开始加水,直至"加水"警示灯灭为止。注水完毕后,在注水口盖上黄铜塞,用手指按紧。

(3) 然后给加温盘中注入 3/4 的灭菌蒸馏水,加温盘应该直接放在恒温箱底板上,加温盘中的水位应该经常检查,应保证 1 周换 2 次水,以免微生物繁殖。

(4) 再设置恒温箱工作温度,在初始工作温度设定之前,打开监视模板上的电源开关,选择控制板上的按钮,使温度显示所需要的工作温度。如果要求箱内的温度为 37℃,则可以将温度调到 37℃ 位置。

(5) 超温安全保护温度可在恒温箱内的温度稳定后设置。按下报警的温度设置按钮,用控制板上的旋钮使温度显示所需的工作温度,超出则报警。

(6) 最后,当恒温箱内的温度和湿度稳定后,充入二氧化碳,接通二氧化碳供给管接头,检查连接部分是否有漏气,二氧化碳供给源的压力应控制在 5～10PSI。检查二氧化碳零点是否准确,设置二氧化碳百分含量时,按下二氧化碳开/关键,旋转二氧化碳浓度设置旋钮,直至指标的二氧化碳含量达到要求的浓度。

(7) 上述设置完毕,开机平衡 48～72h 后方可使用。 

( 四 ) 实体显微镜

实体显微镜也称解剖镜、立体显微镜、体视显微镜,主要用于观察和分离一些较小的组织和器官。胚胎操作中,主要用于小鼠输卵管中胚胎的收集、小鼠的胚胎移植、各种动物胚胎的观察等。简单的胚胎操作也可以在实体显微镜下进行,如徒手切割胚胎等。用实体显微镜观察动物胚胎时,应先用低倍镜头在大视野下找到胚胎的位置,然后调到高倍镜头检查胚胎的质量。如图5-8-2 、图5-8-3。

( 五 ) 倒置显微镜

倒置显微镜是指物镜在载物台下面,可以从培养皿或载玻片的下方观察胚胎或其他培养物。由于物镜在载物台的下方,所以载物台上方的工作距离就可以很长,便于进行显微操作。脏胎操作所用的倒置显微镜应配置很好的微分干涉差系统(DIC,differential interference constrast;Nomarski 或 Smith),一般用的是 180～400倍放大。在引针和选卵时,低倍放大(50×)可以得到较大的操作视野,并不需要 DIC 光学系统。通常,只有在显微操作的放大率为200×时才需要DIC 。

( 六 ) 显微操作仪 .

显微操作仪主要由持针架、调节装置和抗震台组成。显微操作仪与倒置显微镜组合在一起,即构成显微操作系统,如图 5-8-4、图 5-8-5所示。

1. 持针架

显微操作仪厂家都提供一些持针架或管周颈圈套件。例如 Leica 的持针架即为一种管周颈圈套件,将装有适配垫圈的两个黄铜配件固定,形成紧密的连接。该组件盖有一金属螺纹帽,可对所环绕的操作针加以调节,形成一个防漏垫圈。垫圈直径应该与操作针的外径相匹，并需要经常替换,使所用的管子有效。

2. 显微操作仪的调节装置

显微操作仪具有一些可调的刻度盘,用以调节操纵杆的灵敏度和张力。对显微操作仪上所进行的各种调节,应该请教合格的技术人员示范。并非所有的调节全能在旋钮和刻度盘上明白显示。

3. 抗震台

在显微操作时,轻微的震动也会使胚胎受到破坏。为避免这种失误,必须使用抗震台。常用的抗震台是由重量较大的金属制成的基座。在特定情况下,实验室的位置与环境也有一定的影响作用。

( 七 ) 显微注射系统

显微注射系统是专门用于 DNA 显微注射的显微操作系统。显微注射系统分为气动系统和油动系统。气动系统也可与电控传输系统相结合,以对液体传递的体积、时间和压力进行预编程的调节。油动系统是将显微注射器组件经由弹性软管与注射针和持针架连在一起,注射针筒灌上硅油或石蜡油。显微注射针固定器和针本身可充满液体来作缓冲控制,而不必反复调节注射针即可使 DNA 持续流动。用千分尺组件精确调节所需正负压力。现在已开发出电子递送系统控制培养细胞注射的自动显微注射器,并已用于 DNA 显微注射。电子递送系统可对液体的递送量、时间和压力进行控制。压力控制包括静态的持定压、注射时的渐增压和清洗注射针头的较高压力的独立调节器。比起手控的千分尺注射器系统,自动注射器的优点包括可用一个脚踏开关来启动注射压力以及在注射时为较容易穿透卵而可形成两种液压。对新手来说,关键的技巧是能够控制显微注射针中 DNA 的流动。若流动过快,随着 DNA 溶液进入原核,不易控制 DNA 溶液的量,卵容易裂解。若流动过慢,会造成机械损伤,注射后卵会立即死亡。在手控系统中,必需经反复练习,掌握两种极端之间的连续流动速度。自动系统则省去费 时的训练阶段。选择注射系统时,应对注射者的技术、技巧和训练等所有因素进行权衡。

显微注射系统的使用程序如下。

(1) 将调压器开关调至"关"状态,并将调压器电压调到"0"刻度处。

(2) 先将主机电源插头和调压器相连,再将稳压器插头接入到 220V 稳压电源。

(3) 调整两目镜间距至适当距离。

(4) 将调压器开关调至"开"状态,并将调压器电压调到"5V"刻度处左右 , 切不可超越红色警戒线。

(5) 将物镜先调到最高倍数,调整光栅至亮度适合为止。

(6) 物镜转至低倍,选择观察物,调节焦距至清晰后转高倍物镜,继续调节焦距至清晰。调到最大倍数清晰时即可注射基因。

(7) 注射完成后,卸下注射针,将物镜转至空挡,以免灰尘污染物镜。

(8) 将调压器电压调至"0"刻度处,关闭调压器开关。拔下主机电源和调压器电源,盖好防护罩。

(9) 仪器使用完毕后,填写好使用登记。

注意,本仪器专人使用,他人不得随意操作。

( 八 ) 荧光显微镜

荧光显微技术是以紫外线为光源,用以照射被检物体使之发出荧光,然后在显微镜下观察其形状及其所在位置的一种镜检技术。配置荧光系统的显微镜称为荧光显微镜。利用这种技术,不仅可以观察固定的切片标本,而且还可以在活体染色以后进行活细胞的细胞学研究。例如:在转基因动物的研究中,用GFP(绿色荧光蛋白)作为标记基因,就可以在荧光显微镜下,对其早期胚胎观察外源基因的表达情况,进而还可以进行基因定位观察。荧光显微镜与普通 显微镜基本结构是相同的。不同之处在于:①光源不同;②集光器的镜口率高于物镜;③有时,在光源与标本之间所用的透镜是用石英或能透过紫外线的玻璃构成,在载物台下的反射镜面是涂铝的或为石英三棱镜;④第一和第二滤光镜的互补作用,先由第一滤光镜滤去光波长的光线,让紫外光透过来,然后在第二滤光镜使可见光通过,而滤掉其他由第一滤光镜透过来的所有光线。

( 九 ) 细胞融合仪

细胞融合仪是进行细胞融合的专门仪器。在预融合时可产生一种独特的高频交流波,使细胞排列成双体或珠链,以便融合的进行,提高了融合的效率。在融合阶段,交流波和直流波的转换之间设有微秒开关,能在极短时间内从交流电转成直流电。在方波长2波的作用下,使细胞高效融合。融合完成后,立即产生低电压的交流波,可使已初步融合的细胞更完美地聚集 在一起。在克隆动物的研究中,细胞融合仪是必不可少的设备。供体细胞与受体卵母细胞的融合以及重构胚的激活就是依靠细胞融合仪完成(图 5-8-6)。

( 十 ) 程序冷冻仪和液氮容器

程序冷冻仪也称程序降温仪,适用于胚胎冷冻而量身设计的程序冷冻仪也称胚胎冷冻仪。

脏胎冷冻仪使用液氮作为制冷剂,一般控温范围为 170～-100 ℃ , 控温速率为 0.1～5.0 ℃,控温精度为 0.01 ℃。

液氮容器也称液氮罐,有不同的类型及规格。液氮温度低达 -196 ℃,使用时要防止冻伤。由于液氮不断挥发,应注意观察存留液氮的情况 , 定期补充液氮,避免挥发过多、存留量不足而

使细胞受损 ( 图 5-8-7)。

( 十一 ) 拉针器

拉针器是专门用于拉制显微注射针和持卵针的设备,有垂直款式的和水平款式的。使用拉针器时,要先通过反复试验,确定理想的加热值和加热时间等各种参数(图5-8-8)。

( 十二 ) 煅烧器

锻烧器是专门用于锻烧持卵针、使其端部十分平滑的设备,由主板(辅助光、加热丝)、目镜装有测微尺的横位实体显微镜、控制加热丝变压器及可作三维移动的吸管固定支架组成,经拉针器拉制的持卵针端部在显微镜下观察是很细的,不能直接用于固定胚胎,必须先把拉制的针在所需的直径处断开,形成一个平面,再经高温缎烧形成光滑的平口（图5-8-9）

( 十三 ) 磨针器

磨针器是加工注射针口径的仪器,由显微镜和可以变速的转轮构成。转轮有两种形式,一种是转轮本身就是细砂轮;另一种是转轮上可盖有砂纸,根据需求的不同配置不同细度的阶纸。经拉制的各种注射针或切割针,在磨针器下将其端口磨成平整的斜面,以避免对细胞的损伤(图 5-8-10)。