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摘要：目的 该文通过观察异丙酚和氯胺酮对电休克（ECT）后 WKY 大鼠认知和 Tau 蛋白过度磷酸化的影响，探讨异丙酚和氯胺酮对 Tau 蛋白过度磷酸化的调节及两者对抑郁大鼠认知的影响。方法 采用随机单位组析因设计 2 个干预因素，即电休克干预（2 水平：无处置、施行 1 疗程 ECT）和异丙酚、氯胺酮干预（3 水平：注射生理盐水、异丙酚、氯胺酮）的所有组合（2×3 析因设计）进行实验。全部 ECT 处置结束 24 h 内开始 Morris水迷宫检测，然后留取各组大鼠海马组织。高效液相色谱法检测海马组织中神经递质 Glu 含量；Western blot检测 Tau 5（总 Tau 蛋白）、p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262在海马组织中的表达。结果 ECT 和实验药物均可造成大鼠认知障碍，即延长逃避潜伏期并缩短空间探索时间；ECT 和实验药物合用之后，其造成的大鼠认知障碍程度反而减轻。ECT 可增加海马中磷酸化 Tau 蛋白的表达；异丙酚和氯胺酮可使电休克造成的海马磷酸化 Tau 蛋白的表达增加的幅度降低。结论 异丙酚和氯胺酮可使 ECT 造成的海马磷酸化 Tau 蛋白的表达增加的幅度降低，从而改善 ECT 后的认知障碍。

关键词： 异丙酚；氯胺酮；电休克；认知能力；Tau 蛋白；过度磷酸化

Tau 蛋白促进轴突微管的装配和稳定，保持微管间的距离，影响神经细胞轴突的物质运输功能，Tau被异常磷酸化后阻碍微管的组装过程，造成相关神经递质的运输、储存和释放障碍，导致认知损害。

抑郁症是一种常见的、严重的精神疾病，其终生患病率为 17.1%。电休克（electroconvulsive therapy，ECT）是治疗抑郁症的有效的方法，发作时间超过120～180 s 的 ECT 与认知损坏高度有关，其原因可能与强应激有关。应激可通过离子型 GluR 激活来调节 Tau 蛋白的磷酸化，兴奋性神经传递系统的激活，在应激诱导的海马 Tau 蛋白的磷酸化中发挥重要的作用。已知，异丙酚和氯胺酮均可不同程度抑制神经兴奋性毒性；那么 ECT 等应激引起的谷氨酸（glutamate，Glu）升高是否通过上调 Tau 蛋白的过度磷酸化而造成认知障碍，异丙酚和氯胺酮是否可以阻止该过程，其分子机制和信号转导通路为何，成为关注焦点。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

纯品 Propofo（lSigma 公司）；纯品 Ketamine（Sig-ma 公司）；纯品 L- 谷氨酸（L-Glu，Sigma 公司）；小鼠抗牛 Tau5 单克隆抗体（Millipore 公司）；兔抗牛 p-PHF1Ser396/404单克隆抗体 （Abcam 公司）；兔抗人p-AT8Ser199/202多克隆抗体（Invitrogen 公司）；兔抗人p-12E8Ser262多克隆抗体 （Life Span Biosciences 公司）。

1.2 仪器设备

SuperMaze Morris 水迷宫视频分析系统（上海欣软信息科技有限公司）；Harvard 啮齿类动物电休克仪（美国自然基金有限公司）；HPLC 色谱系统（美国 Waers 公司）；蛋白电泳系统（美国 Bio Rad 公司）；金盘多媒体图像处理系统（成都金盘电子科大多媒体技术有限公司）；光学显微照相系统（Olympus45，日本 Olympus 公司）。

1.3 实验动物

24 周健康雌性 Wistar-Kyoto（WKY）大鼠，体质量 200～250 g，由中国科学院上海实验动物中心提供；WKY 大鼠来源于京都大学远系繁殖的 Wistar 大鼠，其天生对应激具有高反应且行为表现出内源性的抑郁症状，包括精神活动延迟、行动迟缓、快感缺乏等。该特性在 WKY 雌鼠身上表现更为普遍，故该模型可作为抑郁动物模型。WKY 大鼠置于通风良好、12 h 明暗交替、自由饮水和摄食条件下，每日触摸 2 min。适应性饲养 1 周后，进行旷场行为测试，测试均于上午 9：00开始，选取水平得分和处置得分的总分 30～120 s 间的 48 只大鼠。

1.4 实验方法

1.4.1 动物实验原则 所有动物实验均按照美国医学研究协会《实验动物处理原则》以及美国科学学会和国家卫生研究院《实验动物使用和处理指南》进行。

1.4.2 实验动物分组 采用随机单位组析因设计：每只大鼠视为 1 个单位，对每单位施加 2 个处理因素，即 ECT 处置与否（2 水平：无处置、施行 1 个疗程ECT）和实验药物使用与否（3 水平：注射生理盐水、异丙酚、氯胺酮）的所有组合（2×3 析因设计）。

1.4.3 实验动物干预措施 通过随机数字发生器将48 只 WKY 大鼠随机分为 6 组（n =8）：生理盐水组（静脉注射 2 mL 生理盐水）、异丙酚组（静脉注射 2mL 5 mg/kg 异丙酚）、氯胺酮组（静脉注射 2 mL 5mg/kg 氯胺酮）、生理盐水 +ECT 组（静脉注射 2 mL生理盐水 +ECT 1 疗程）、异丙酚 +ECT 组（静脉注射2 mL 5 mg/kg 异丙酚 +ECT 1 疗程）、氯胺酮+ECT 组（静脉注射 2 mL 5 mg/kg 氯胺酮 +ECT 1 疗程）。

1.4.4 ECT 处置 每次施行 ECT 前 15 min 静脉注射相应药物，然后于大鼠双颞侧安放电极，采用 Har-vard 啮齿类动物电休克仪行 ECT 处理，给予方波（单个正弦半波 20 ms，50 Hz）、电流 50 mA、持续 1 s的电刺激，引起大鼠强直阵挛抽搐发作视为治疗成功，隔天 1 次，共 7 次，均于上午 9：00 开始进行。不施行 ECT 处置的实验组与施行 ECT 组，在同样时间以同样频率和剂量注射相应药物。

1.4.5 Morris 水迷宫视频分析系统检测实验大鼠的认知功能 （同参考资料）

1.4.6 取材 在 Morris 水迷宫测试结束后 24 h 内取大鼠的海马。大鼠左侧海马均分为 A、B 两份，A份用锡箔纸标记包裹后置于液氮中过夜，然后置于-80℃超低温冰箱中保存，备做 Western blot；B 份称重，加入 1 mL 甲醇 - 水离心液，低温匀浆，取部分匀浆液 4℃、10 000 g 离心 15 min，取上清，滤膜过滤后 -80℃保存，待测 Glu 的含量（组织中含量以 μg/g 计）。大鼠右侧海马置于 4℃的 10%多聚甲醛中固定 3 d，脱水，石蜡包埋、切片（厚度 1μm），备行免疫组织化学 SP 法显色。

1.4.7 高效液相色谱法检测神经递质 Glu 在大鼠海马组织中的含量 同参考资料

1.4.8 Western blot 检测 Tau5（总 Tau 蛋白）、p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262在大鼠海马组织神经元中的含量 取 A 份大鼠左侧海马，匀浆，取 0.2 g，经 Western blot 及 IP 细胞裂解液提取蛋白，再用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，据此调节蛋白浓度一致。取等量蛋白样品，用 5×SDS 加样缓冲液按 1∶1（V/V） 稀释待测样品，于100℃煮沸 5 min；另用 1×SDS 加样缓冲液溶解预染蛋白质分子量标准混合物，置于 100℃煮沸 3 min。取待测标本 15μL 上样 [甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase，GAPDH，1∶200）作为蛋白质上样量的标定]，经SDS-PAGE电泳至预染蛋白质分子量标准所示目的分子量出现为止，用湿法将蛋白条带电转至 Immun-blottingPVDF 膜，50 g/L 脱脂奶粉封闭 3 h，加入相应抗体（小鼠抗牛 Tau5 单克隆抗体、兔抗牛p-PHF1Ser396/404单克隆抗体、兔抗人 p-AT8Ser199/202多克隆抗体、兔抗人 p-12E8Ser262多克隆抗体）（1∶200）4℃孵育过夜，相应辣根酶标记 IgG（1∶200）37℃孵育 2 h，DAB 显色，金盘多媒体图像处理系统测定阳性条带的积分吸光度值。

1.5 统计学方法

采用 SPSS 17.0 软件包进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，对各组样本进行方差齐性检验，经检验方差齐。将各组样本进行析因设计，单因素方差分析各处理因素主效应和交互效应，P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ECT和实验药物对 WKY 大鼠认知功能的影响

ECT 和实验药物（异丙酚和氯胺酮）均可造成认知障碍，即延长逃避潜伏期（ECT：F=25.574，P=0.001；实验药物：F =11.125，P =0.003）、缩短空间探索时间（ECT：F =29.852，P =0.006；实验药物：F =21.193，P =0.001）；但两者合用的影响呈相减效应，即 ECT 和实验药物合用之后，认知障碍程度反而减轻（逃避潜伏期：F=122.096，P=0.001；空间探索时间：F=113.536，P =0.012），见表 1、2。

2.2 ECT 和实验药物对 WKY 大鼠海马中 Glu 含量的影响

ECT 可明显增加海马中神经递质 Glu 的浓度（F=275.182，P =0.005）；实验药物（异丙酚、氯胺酮）对海马中神经递质 Glu 的浓度无明确影响（F =0.101，P =0.825）；ECT 和实验药物合用亦未见交互效应（F=0.402，P =0.712），见表 3。

2.3 ECT 和实验药物对 WKY 大鼠海马组织神经元中 Tau 蛋白表达的影响

ECT 和实验药物对海马总 Tau 蛋白（Tau5 蛋白）的表达均无明显影响（ECT：F =0.655，P =0.451；实验药物：F =0.041，P =0.935）；而且 ECT 和实验药物合用亦未见交互效应（F =0.134，P =0.651），见表 4 及附图。

ECT 可增加海马中磷酸化 Tau 蛋白的表达（p-PHF1Ser396/404：F=38.906，P =0.008；p-AT8Ser199/202：F =178.482，P =0.000；p-12E8Ser262：F =35.634，P =0.000）；实验药物可减少海马中磷酸化 Tau 蛋白的表达（p-PHF1Ser396/404：F =63.825，P =0.000；p-AT8Ser199/202：F =74.813，P =0.009；p-12E8Ser262：F =101.340，P =0.000）；两者合用的影响呈相减效应 （p-PHF1Ser396/404：F =5.264，P =0.014；p-AT8Ser199/202：F =44.712，P =0.001；p-12E8Ser262：F =50.714，P =0.005），即异丙酚和氯胺酮可使 ECT造成的海马中磷酸化 Tau 蛋白表达增加的幅度降低。

3 讨论

3.1 Tau 蛋白过磷酸化与认知及 Tau 蛋白过磷酸化的信号传导机制

Tau 蛋白过度磷酸化可降低轴突转运的效率，神经信号传递的障碍及突触退化，甚至造成神经元凋亡或死亡，从而导致认知损害。本实验证实，认知能力与 Tau 过度磷酸化有关，表现为 Tau 蛋白磷酸化程度愈高者认知能力越差。本实验还发现，总 Tau蛋白的表达在神经元 ECT 应激前后没有明显变化，在诸过度磷酸化位点中，Ser199/202 的磷酸化程度与 ECT 应激关系最为紧密，似乎在导致认知障碍的Tau 蛋白过度磷酸化机制中扮演主要角色。这可能与 Ser199/202 位点定位于微管结合区，其磷酸化参与调节 Tau 蛋白与微管的结合活性有关。

Tau 蛋白过度磷酸化的内源性机制是由于脑中Tau 蛋白自身的代谢异常导致的；Tau 蛋白过度磷酸化的外源性机制是蛋白激酶和蛋白磷酸酶的平衡失调引起的。GSK-3β 是一种多功能的丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶，是目前发现最强有力的 Tau 蛋白激酶，催化 Tau 蛋白多个位点的磷酸化，其中包括Thr181、Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr217、Thr231、Ser396 和 Ser404。

本实验中观察到 ECT 后 Glu 在神经元中的浓度明显升高，与 WU 等发现应激可激活兴奋性神经传递系统诱导海马 Tau 蛋白过磷酸化的研究结果一致。而 Glu 抑制包括 Akt 等多种蛋白激酶的活性，Akt 是 GSK-3β 的上游调节分子，而 GSK-3β 是使Tau 蛋白发生过度磷酸化的关键磷酸酶，故推测相关信号传导途径如下：ECT 应激导致 Glu 浓度升高→Akt 活性抑制→GSK-3β 活性升高→Tau 蛋白磷酸化程度增加。

3.2 兴奋性氨基酸 Glu 与认知脑内 Glu 释放过多，过度激动膜电位依赖式GluR 导致 Ca2+大量内流，激活对 Ca2+敏感的各种酶类，产生自由基激活磷酸肌醇环路，使神经元变性，造成认知障碍。ECT 后认知障碍与 GluR 过度激动引起氧化应激、导致海马 LTP 饱和状态、造成突触可塑性障碍有关。NMDAR 的激动可以通过激活GSK-3β、酪蛋白激酶 2 和肌动蛋白聚合作用以增加 Tau 磷酸化程度，从而损伤神经元；而 NMDAR 拮抗剂可从受体水平阻断 Glu 的兴奋性毒性，从而使得经由 GSK-3β 增加 Tau 蛋白过度磷酸化程度的神经损伤过程中断。

本实验结果表明，ECT 导致海马中 Glu 浓度明显上升，说明 Glu 诱导的兴奋性毒性很可能参与 ECT导致的认知功能障碍机制。实验也表明，异丙酚和氯胺酮对海马中神经递质 Glu 的浓度、海马总 Tau 蛋白没有明确影响，ECT 和实验药物合用亦未见交互效应，提示异丙酚和氯胺酮对海马中 Tau 蛋白磷酸化的干预，不是通过影响海马中 Glu 浓度发挥作用，其更可能是作为 GluR 的阻滞剂而阻断海马中Glu诱发的认知功能障碍。

3.3 氯胺酮缓解 ECT 后学习记忆障碍

本实验发现盐酸氯胺酮单独使用，会导致认知减退，但与 ECT 合用则可明显减轻 ECT 后的认知障碍。本实验发现，盐酸氯胺酮对减少海马中 Glu 的浓度无明显影响，但氯胺酮可以发挥类似 GluR 拮抗剂的作用，明显减轻兴奋性毒性反应，并减缓 Tau 蛋白过度磷酸化程度，最终改善认知状况。结合既往研究，推测其机制如下：氯胺酮属于非竞争性 NMDA受体拮抗剂，与 NMDA 受体通道复合物的苯环己哌啶调节位点结合，通过变构调节来干扰兴奋性氨基酸与 NMDA 受体的正常结合，减轻 NMDA 受体过度激活所致的氧自由基损伤。氯胺酮还可通过阻断已开放通道及降低通道，开放频率而阻滞 NM-DA 受体。本研究与 LOO 等的研究结论一致，LOO 认为盐酸氯能够减轻 ECT 后的认知功能障碍，尤其在 ECT 后的 1 周之内效果明显。

3.4 异丙酚缓解 ECT 后学习记忆障碍

本实验发现，异丙酚单独使用会导致学习记忆减退，但与 ECT 合用则可明显减轻 ECT 后的学习记忆障碍，这两点与大多数研究一致。实验发现无论施行 ECT 与否，异丙酚对海马中 Glu 的浓度无明显影响，但异丙酚与氯胺酮同样具有类似 GluR 阻滞剂的作用，减缓兴奋性毒性诱发的 Tau 蛋白过度磷酸化进程，改善 ECT 后的认知障碍。

结合既往研究，推测其机制如下：①异丙酚的苯环基团可作用于 NMDAR 的苯环己哌啶结合位点，非竞争性拮抗 NMDAR，缩短兴奋性突触后电位持续时间，减少因 NMDAR 过度兴奋导致的神经元损伤。②异丙酚还可通过升高 Akt 活性抑制神经元凋亡。③异丙酚直接作为 NMDAR 阻滞剂而发挥作用，逆转 ECT 后学习记忆障碍。

来源：上海欣软信息科技有限公司

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