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实验方法

酵母人工染色体

2015年09月09日 浏览量: 评论(0) 来源:《人类疾病动物模型》 作者:刘恩岐 李亮平 师长宏 责任编辑:wlladmin
摘要:酵母人工染色体

酵母人工染色体(yeast artificial chromosomes, YAC)是一种人工构建的酵母染色体,线性分子,具有自我复制的能力,可作为超大容量载体克隆大型基因或包括数个较大基因的外源基因组DNA序列(大至2Mb的大片段线性DNA分子)。酵母是YAC的宿主细胞,为真核细胞。酵母的培养方法与大肠埃希菌相似,简单方便。

1.YAC的结构  Murray等于1983年将三组元件(端粒、着丝粒和DNA复制起始区)连接在一个载体上,构建了第一个酵母人工染色体。YAC两端有端粒(telomere, TEL)序列,可封闭和保护染色体DNA两个末端;YAC结构分左右臂,左臂含有DNA复制起始区(origin of replication)、着丝粒(centromere, CEN)序列和酵母营养表型筛选标记,如色氨酸TRP1基因,参与染色体DNA复制起始结构的形成和染色体的分离。右臂有另一个酵母选择性标志,如URA3基因,中间可克隆外源DNA序列,长度从10~2000kb不等。

2.YAC的优点  ①YAC可克隆巨大基因,YAC载体的突出优点是容载能力大,可插入高达2000kb的片段。②酵母细胞具有高效的同源重组机制,可对YAC DNA序列进行精确的修饰,如对 YAC进行从小至几个碱基的突变到对目的大片段 DNA的缺失、置换等定点打靶修饰。还可以将两个不同的但具有部分同源序列的YAC DNA通过同源重组的方法拼接在一起,以构建更大的YAC。YAC的缺点:①存在嵌合现象(chimerism):一个YAC克隆的插入DNA序列可能来自2个或多个不同位置的DNA片段,嵌合体的比例达10%~50%,这种现象使染色体步行(chromosome walking)和基因分离难度加大。②插入DNA片段的分离和纯化比较困难:YAC的结构与天然酵母染色体非常相似,如果 YAC的大小如与内源性的酵母染色大小相近,难以通过电泳与酵母染色体分离。③YAC克隆的稳定性比较低,插入片段存在重排和丢失现象,特别是YAC中存在重复DNA序列。对YAC基因进行修饰时,YAC DNA序列可能重排和丢失,特别是在减数分裂期将两个YAC进行同源重组时尤为明显,这对 YAC转基因的完整性和物理图谱鉴定都十分不利。

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