体外构建转基因表达载体时，必须对真核细胞的基因调控表达系统有深入的认识。真核细胞基因表达的元件包括启动子(promoter)、polyA添加信号(polyA addition signal)、增强子(enhancer)、沉默子(silencer)和绝缘子(insulator)等。转基因表达载体至少要含有启动子和polyA信号，不少启动子含有增强子元件。最初的转基因载体都是用质粒作为载体的，将真核细胞启动子、目的基因eDNA和 polyA信号克隆于载体中。BAC和YAC等载体系统的出现使科学家可以克隆大的DNA片段，包括基因的原始基因组序列和远处的调控序列，可以使转基因忠实地保持原组织细胞的表达特性。

启动子是能与RNA聚合酶结合而触发RNA转录的DNA序列，使RNA聚合酶与模板DNA准确结合，起始RNA转录。mRNA由RNA聚合酶Ⅱ合成。真核启动子由核心启动子和上游启动子元件构成。启动子有方向性，必须位于结构基因的5'端上游。

启动子一般分为广谱表达型启动子和组织特异性启动子。广谱表达型启动子几乎可使驱动的基因在所有的细胞里表达；组织特异性启动子则驱动基因在某种细胞里表达。有许多组织特异性启动子，可驱动基因在某种组织细胞表达。值得注意的是，这种组织特异性表达并非是绝对的。

常用的广谱表达型启动子如下：①CMV启动子：为CMV病毒的强启动子，应用广泛；②CAC启动子：为人工改建的启动子，由CMV-IE增强子与鸡β-肌动蛋白(β-actin)启动子和β-肌动蛋白内含子融合构成；③泛素(ubiquitin)启动子；④小鼠朊蛋白(prion)启动子；⑤β-肌动蛋白启动子等；⑥EIIa、Meu启动子。

常用的组织特异性启动子有：①神经元：烯醇酶启动子(neuron specific enolase, NSE)；②周围神经元：外周蛋白启动子(peripherin)；③骨骼肌和心肌：肌酸激酶启动子(creatine kinase)；④肾远端小管：γ-谷氨酰转移酶启动子(γ-glutamyl transpeptidase  typeⅡ)；⑤肠道上皮细胞：绒毛蛋白(villin)和FABP启动子；⑥皮肤：角蛋白(Keratin, Krt14)；⑦肝：清蛋白(albumin，Alb)；⑧B细胞：CD19；⑨细胞：CD3等。

在cDNA的5'或3'端加入内含子的转基因 DNA片段可以进行基因拼接。基因拼接能产生更加稳定的mRNA，让mRNA从细胞核转移到细胞质更高效，有助于基因更好地表达。天然内含子如 SV40内含子或家兔β球蛋白内含子和人工内含子都可用于转基因载体的构建。

真核转录终止和polyA添加信号序列：真核转录终止信号序列通常位于基因蛋白翻译序列的3'端，包括polyA添加序列(AAUAAA)。来自SV40、 BGH(bovine growth hormone)和HGH(human growth  hormone)的终止序列得到广泛应用。

增强子序列是一种位置、方向独立的基因调控元件，它能调控增强基因表达的模式和水平，转基因的细胞组织特异性表达可以被适当的增强子序列调控。增强子可以位于启动子、内含子或3'UTR(untranslated regions)。如，巢蛋白基因的增强子位于第二个内含子里，能促进转基因在神经上皮细胞的表达。

染色质绝缘子元件是一种染色体上分隔基因的DNA序列，它们在相邻的染色质中与它们的结合蛋白相互作用形成复合体。这些元件在基因组上起屏障作用，保护DNA序列免受邻近序列的干扰，也防止它们和远处的增强子相互作用。研究证明，在外源转基因片段的5'端或5'和3'端加入绝缘子时，如5'HS4鸡β球蛋白基因和小鼠酪氨酸酶基因位点控制区(locus control region, LCR)的绝缘子元件，都可以减少转基因表达的差异性。鸡溶菌酶基因位点也有2个scaffold/matrix-associated区(S/MARs)环绕在基因周围，已证明其在转基因小鼠中有基因表达界定作用。