规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly  interspaced short palindromic repeats, CRISPRs)的发现要追溯到30多年前，它是细菌基因组中的一种序列，这一序列占细菌基因组的大约40％。一个 CRISPR位点是由一串连续排列的短指向性重复序列中间夹杂一些短间隔序列(spacer)，这些重复序列长度为21～47bp，平均为32bp，对于一个给定的 CRISPR来说，它的重复序列长度和序列都是已知的，而spacer则是完全不同的。这些不同的spacer通过比较基因组学发现与许多的噬菌体和质粒 DNA有很高的同源性，后来的研究证实CRISPR通过产生RNA(CRISPR-derived RNA,crRNA)与 CRISPR-associated protein(CRISPR/Cas9)相结合形成识别催化结构，识别外源DNA序列并通过切除突变的方式达到防御自身的作用，又称CRISPR防御体系。

基于Ⅱ型原核CRISPR/Cas9适应性免疫系统，研究者们改造产生了一套用于基因修饰编辑的工具，在这套系统中，包括crRNA和转录激活trans- activating RNA(tracrRNA)，它们一起形成双链RNA并与Cas9结合，由RNA识别DNA序列驱动Cas9定位后，分别由Cas9的HNH和RuvC-like结构域切开DNA的互补链和非互补链。研究者后来以合成的guide RNA(gRNA)代替互补的crRNA和 tracrRNA的功能，也可以与Cas9一起发挥作用产生DSB。利用CRISPR/Cas9系统，研究者已经成功在哺乳动物细胞中实现了基因突变，在Cas9和 gRNA的共同作用下，在人和小鼠细胞中成功诱导特异性DNA识别并产生DSB诱导NHEJ发生(图3-12)。通过与ZFN和TALEN进行indels效率比对发现，三者在删除效率上差距并不明显，但是相比之下CRISPR/Cas9系统要更加简单，操作方便。

图3-12 CRISPR/Cas9基因打靶示意图

在斑马鱼中，CRISPR/Cas9技术也取得了很好的效果，ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术对于斑马鱼基因打靶的价值在于在此之前没有一种合适的方式进行斑马鱼基因敲除，传统方式在斑马鱼上效果很差，而斑马鱼作为发育生物学的重要模型对于基因打靶模型也有着强烈的需求，因而这几项新技术对于它的重要性不言而喻。

还有研究者利用CRISPR的RNA介导DNA定位的方式，通过对Cas9进行改造达到特异性控制基因表达的目的，研究发现突变型Cas9通过结合到基因的编码区上游近ATG区域，从而干扰基因的正常转录达到基因沉默的目的，而且距离ATG越近这种位阻效果越明显。这种RNA介导的调控基因表达的方式相比于RNAi不会将基因表达的 mRNA降解，为基因调控提出了一个新的方向。

最近运用CRISPR/Cas9技术定点修饰基因的小鼠也已经出现，研究者通过NLS-flag-linker-Cas9 mRNA与gRNA共同导入小鼠原核期胚胎中，成功诱导了Pouf5-IRES-EGFP knock-in小鼠后代中大量的 EGFP突变体。不久之后，麻省理工大学的研究组成功地在小鼠ES细胞中实现了五基因(Tet1、2、3， Sry,Uty-8)同时敲除，效率达到了50％以上；他们也通过mRNA原核注射的方式成功生产出Tet1、2基因同时双敲除小鼠，删除效率也在50％以上。这种通过一步法生产多基因敲除或者敲入小鼠的方式将会大大提高生物研究的效率，值得我们好好去思考、研究和利用。

不过研究中也发现，目前的CRISPR/Cas9系统在序列识别严谨性上并不够好，因而虽然有研究声称它的脱靶效应很低，但是由于未能进行全基因组范围大规模测序分析，无法对这一结果进行证实，不少研究者也声明CRISPR/Cas9系统的脱靶效应依然需要大量的后续实验验证，同时对于CRISPR/Cas9系统的gRNA设计方式的改进也是未来一段时间内该技术主要需要突破的部分。不可否认的是CRISPR/ Cas9系统相较ZFN、TALENs更加简单，而且Cas9/gRNA的导入和体外转录都更加容易，而且还有一个优势是其他两种方法无法比拟的，CRISPR/Cas9可以同时进行多基因定点修饰的能力，这也许将成为CRISPR/Cas9系统未来的主要应用范围。