在不删除宿主基因组序列的前提下将外源基因定点整合后控制其高效表达，通过人为控制插入位点可以有效避免基因插入内源基因外显子产生突变、干扰其表达的可能性，还可以尽量避免插入位点效应对于外源基因表达产生的基因沉默，让转基因变得更“靠谱”。不过在敲入位点的选择上研究者们一开始并没有太多明确的标准和选择，直到 ROSA26位点出现后，基因敲入小鼠变得普及、高效起来。研究者在用反转录病毒对ES细胞进行基因捕获(gene trapping)时获得了ROSAβ3geo26(ROSA26)小鼠，发现在插入位点ROSA26中原来表达的两个核RNA转录本消失，而同时β-gal高效且广泛表达，因而可以被广泛用于生产基因敲入小鼠中，而这一位点也在不久后被用于生产LacZ/Cre基因敲入小鼠，获得了很好的实验结果。

常规的ROSA26敲入是将外源基因编码区插入至ROSA26位点的第一内含子中，位于基因捕获位点的上游248bp，限制性内切酶XbaI位点处。同时插的片段中还包含正负筛选基因新霉素抗性基因(neomycin resistance cassette)和白喉毒素基因(diphtheria toxin gene)，以此来筛选获得高效率的同源重组，通常在G418抗性克隆中同源重组率可以达到25％～50％(图3-13)。

图3-13  将外源荧光报告基因导入Rosa位点策略

应用ROSA26位点的主要原因是它的启动子在小鼠体内的广泛表达，虽然表达效果在不同研究中有所差异，但存在这种表达的普遍活性对于动物模型研究具有重要的意义。随后有很多ROSA26基因敲入小鼠模型出现，并被广泛用于医学等研究领域，ROSA26也成了应用最广泛的基因敲入位点。
除了定点插入外源基因外，基因敲入还可以利用同源重组实验特定靶基因的点突变，从而改变该基因的内源表达状态，达到研究基因区域功能和影响的目的。这种方式有时候比直接转入一个新的基因要更加直接、单纯，对于科学研究的目的性更强，也是目前基因敲入的重要应用。

ROSA26位点基因敲入成功解决了转基因动物插入位点不确定、无法预测表达量的问题，但是一直以来基因敲入动物也同时被广泛性全身表达所困扰。这是由于外源基因广泛全身表达可能会造成一些不可预知的表型。大部分研究者关注的是该基因对于体内某些特定组织、器官或者部分区域的影响，而全身性表达无疑让科学研究变得复杂化，而这种复杂的相互作用也是后来系统生物学出现的主要原因。另外，一些外源基因持续表达会引起动物在胚胎期或者孕期致死从而无法获得基因敲入动物后代，或是点突变基因表达会对某一特定时期的细胞调控网络出现紊乱从而影响正常表型。这也就提出了调控转入基因时空特异性表达的问题。为了解决转基因时空特异性表达的问题，研究者们在基因打靶的基础上加入了Cre/loxP重组体系用以调控外源基因表达。